Полностью автоматическая система многоступенчатой фильтрации экзосом и оценка её характеристик

Разработана полностью автоматическая система многоступенчатой фильтрации и разделения экзосом; её характеристики оценены путём выделения экзосом из аутологичных жировых стволовых клеток человека.Методы：Определён процесс разделения, спроектирована конструкция, завершена разработка аппаратного и программного обеспечения.Из аутологичной жировой ткани пациента после ферментативной обработки получили жировые стволовые клетки, культивировали и пересевали их. Супернатант клеток третьего пассажа предварительно центрифугировали, перенесли в резервуар первой ступени и отфильтровали прибором. Фильтрат третьей ступени центрифугировали и выделили экзосомы. С помощьюпросвечивающей электронной микроскопии（Transmission Electron Microscope，TEM) наблюдали морфологию экзосом; выполнили анализ траекторий наночастиц (Nanoparticle Tracking Analysis，NTA），для определения размера и концентрации частиц; методом вестерн-блоттинга (Western Blot) определили экспрессию специфических белков экзосом из жировых стволовых клеток, включаяCD63、CD81、TSG101; одновременно определилиGM130для оценки степени загрязнения везикул в исследуемом образце.Результаты：Завершена разработкаполностью автоматической системы многоступенчатой фильтрации экзосом. Экзосомы из жировых стволовых клеток, полученные после фильтрационного концентрирования и центрифугирования, имели чашевидную форму при просвечивающей электронной микроскопии. По анализу траекторий наночастиц большинство экзосом находилось в диапазоне50nm-200nm. Вестерн-блоттинг показал экспрессиюCD63、CD81、TSG101в выделенных экзосомах; выход экзосом достиг75%, а загрязнение везикул находилось в нормальном диапазоне.Вывод：Полностью автоматическая система многоступенчатой фильтрации обеспечивает быстрое и эффективное разделение экзосом, отвечает требованиям клинического применения и служит надёжной основой для лечения заболеваний с использованием экзосом.

Ключевые слова:экзосомы; жировые стволовые клетки; фильтрация; концентрирование; выделение

Multistage Filtration Based Fully Automated Exosomes Separation Instrument and Its Performance Evaluation

Zeng Yangtian¹ Zheng Yi² Liu Kai^2* Li Hong^1*

1(Hangzhou Baiqiao Medical Technology Co.,Ltd., Hangzhou 310018)

2 (Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011)

3 (EVERFINE Test and Calibration Technology Co., Ltd, Hangzhou, Hangzhou 310053)

Abstract: Objective: to develop a fully automated multistage filtration instrument for the separation of exosomes and to evaluate the performance by extracting human autologous adipose-derived stem cells(ADSCs) exosomes. Methods: To determine the instrument separation process, design the instrument structure and complete the instrument development of both hardware and software; to obtain and digest the autologous fat from patients, obtain and subculture the adipose-derived stem cells, collect the supernatant of the third generation adipose-derived stem cell culture and make initial centrifugation, add the supernatant to the first reservoir then filter through the instrument, centrifuge the obtained third stage filtrate and extract exosomes. The morphology of the exosomes was observed by Transmission Electron Microscope (TEM). Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) was performed to analyze particle size and concentration. Western Blot (WB)was used to detect the specific protein expression of the adipose-derived stem cells exosomes, which including CD63, CD81, TSG101 and GM130.And the Western Blot Method also was used to detect the contamination extent of vesicles in the assay samples. Results: The development of a fully automated multistage filtration and separation instrument for exosomes was completed. The adipose-derived stem cell exosomes, which extracted by the instrument after filtration and concentration and centrifugation, were observed in a circular-cup shape by TEM. Most of the exosomes obtained by NTA were in the range of 50 nm-200 nm. WB showed that the extracted exosomes contained the expression of CD63, CD81, TSG101 and CD81. Exosomes were obtained up to 75% and vesicle contamination was within the normal range. Conclusion: The fully automated multistage filtration and separation of exosomes instrument can achieve efficient and rapid separation of exosomes, which meets the requirements of clinical application and provides a strong support for clinical exosomes in disease treatment.

Keywords: Exosomes; Adipose-Derived Stem Cells; Filtration; Concentration; Extraction

Введение

Экзосомы (exosome) — внеклеточные везикулы диаметром30～150nmвнеклеточных везикул^[1-3]. Исследования^[4-8]показывают, что экзосомы широко представлены в моче, плевральном и брюшном выпоте, молоке, слюне и других биологических жидкостях. Их секретируют многие клетки, включаяMSCs, клетки крови, эндотелиальные, нервные и опухолевые клетки. Экзосомы переносят большой объём внутриклеточной и внеклеточной информации, служат посредниками межклеточной коммуникации и ремоделирования внеклеточного матрикса и тесно связаны со здоровьем и заболеваниями человека.^[9-10]，Аэрозольное введениеMSC-EVsимеет большое значение для лечения острого респираторного дистресс-синдрома^[11]; Zhu Hongyan^[12]и коллеги показали, чтоCBSA/siS100A4значительно подавляет рост злокачественных клеток рака молочной железы; группа Ma Taotao^[13]установила важную роль экзосом-опосредованного взаимодействия эпителия почечных канальцев с макрофагами при лечении диабетической нефропатии; группа профессора Zhang Songying^[14]обнаружила, что регулирование метаболизма децидуальныхNKклеток материнского происхождения улучшает секрецию децидуальнымиNKклетками факторов, необходимых для развития плаценты.Поскольку экзосомы приобрели важное значение в клинической диагностике, лечении заболеваний и регенерации тканей, исследователи во всём мире всё глубже изучают их особые свойства и структуру.

Традиционные методы разделения экзосом включают ультрацентрифугирование, фильтрацию, иммуномагнитные частицы и микрофлюидные чипы^[15]. Ультрацентрифугирование трудно широко применять из-за дорогого оборудования; иммуномагнитный метод привносит посторонние компоненты и потому сложен для клиники; микрофлюидные чипы дают высокую чистоту, но малый выход; фильтрация технологически зрелая, однако ручная, трудоёмкая, длительная и склонна к загрязнению.^[16-17]。

В работе усовершенствован метод фильтрации: оптимизированы размер пор и число ступеней, разработано интеллектуальное управление всем процессом, чтобы обеспечить эффективное, быстрое и безопасное клиническое применение; экспериментально оценено получение экзосом прибором.

1 Методы

1.1 Конструкция прибора

1.1.1 Общий состав прибора

Прибор состоит из двух резервуаров, многоступенчатого фильтрующего блока, драйвера двигателя, плунжерного насоса, двух датчиков давления, двигателя, линейного привода и сенсорного экрана (рис.1). Система управляетсяPLCи модулем сбора данных. Показания датчиков давления в реальном времени выводятся на сенсорный экран, через который выполняется управление. Предусмотрены автоматический и ручной режимы, переключаемые по условиям работы.

1.1.2 Рабочий процесс прибора

Процесс концентрирования целевой жидкости показан на рис.2: жидкость заливают в резервуар № 1 и включают питание. Контроллер управляет драйвером двигателя, который запускает и останавливает двигатель. При запуске линейный механизм приводит плунжерный насос; всасывающая трубка забирает жидкость из резервуара № 1 и подаёт её по трубопроводу в многоступенчатый фильтрующий блок. На входе и выходе установлены датчики давления, которые в реальном времени измеряютразность показаний датчиков камер стабилизации давления первой и второй ступени. По величине разности регулируется время включения плунжерного насоса, чтобы поддерживать постоянный перепад давления в фильтрующем блоке. Жидкость проходит через многоступенчатый блок, где автоматически фильтруются частицы разных диаметров. После завершения частицы меньше размера пор нижней мембраны и отходы поступают по конечной линии в резервуар № 2; исследователь извлекает целевой продукт из фильтрующего блока.

Рисунок1 Полностью автоматическая системавыделения и концентрирования экзосомприбор

Fig.1 Automatic Exosome Filtration Instrument

Рисунок2 Схема рабочего процесса

Fig.2 Instrument work flow chart

1.2 Оценка характеристик прибора

1.2.1 Экспериментальные материалы

1.2.1.1 Основные реактивы

Добавка для культивирования жировых стволовых клеток (UltraGRO^TM，AventaCell BioMedical, США);PBS（Gibco, США)；0.25%Трипсин (Gibco, США); фетальная бычья сыворотка (Gibco, США); смесь трёх антибиотиков (Gibco，США);α-MEM, среды с низким и высоким содержанием глюкозыDMEM（Gibco, США); коллагеназа (Collagenase NB4，Serva, Германия); BCAНабор для количественного определения белка (Beyotime, Китай).

1.2.1.2Основное экспериментальное оборудование

Одноразовые стерильные10 cmчашки для культивирования (BD, США)；100 kDaультрафильтрационные пробирки (Milipore, США)；Ламинарный бокс (Suzhou Purification Equipment Co., Ltd., Китай); микропланшетный ридер (Thermo Fisher Scientific, США)；Микровесы (Longcheng Instrument Equipment Co., Ltd., Китай); проточный цитометр (Beckman，США)；Настольная центрифуга с регулируемой температурой(Thermo Fisher Scientific, США);Камера для подсчёта клеток (Shanghai Qiujing Biochemical Reagent Instrument Co., Ltd., Китай)；Термостатируемый шейкер (Taicang Huamei Biochemical Instrument Factory, Китай)；Термостатическая водяная баня (Shanghai Hetian Scientific Instruments Co., Ltd., Китай).

1.2.2 Методы эксперимента

1.2.2.1Выделение и культивирование жировых стволовых клеток

Жировую ткань получали из области живота или внутренней поверхности бедра как отходы после липосакции. Пациенты подписали информированное согласие на передачу материала для медицинских исследований. Протокол одобрен этическим комитетом Девятой народной больницы при Медицинской школе Шанхайского университета Цзяотун.

Полученную жировую ткань обрабатывали коллагеназой и после центрифугирования выделяли первичные жировые стволовые клетки. Клетки высевали вα-MEMсреду с добавкой для культивирования жировых стволовых клеток в10cmчашки и культивировали при5%CO₂，37℃. Когда клетки достигали примерно80%-90%конфлюэнтности, применялиEDTAсодержащий0.25%Клетки пассировали после обработки трипсином. Для выделения экзосом использовали адипозные стволовые клетки3поколения.

1.2.2.2Выделение экзосом из адипозных стволовых клеток

Собранную3среду от адипозных стволовых клеток поколения перелили в приёмный резервуар установки для выделения экзосом и выполнили фильтрацию. Полученный фильтрат внесли в100kDaсодержащийmiliporeультрафильтрационные пробирки и выделили экзосомы методом ультрафильтрации. При3000g，15-20min，4°C центрифугировали до почти полного удаления надосадочной жидкости из внутренней части ультрафильтрационной пробирки, затем один раз промылиPBSи центрифугировали до остаточного объёма во внутренней пробирке всего200-500μLсодержащего экзосомыPBS. После центрифугирования отобрали содержащий экзосомыPBSи хранили в холодильнике при4°C.

1.2.2.3Идентификация экзосом из адипозных стволовых клеток

При существующих методах разделения трудно получить исключительно чистые и однородные экзосомы, поэтому экзосомы, полученные центрифугированием после концентрирования на установке, необходимо идентифицировать. В данном исследовании для обеспечения точности использовали три метода согласно стандартам Международного общества внеклеточных везикул.① Наблюдение морфологии предварительно обработанных экзосом с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM)^[18];② Анализ отслеживания наночастиц по размеру (NTA): частицы в экзосомной суспензии освещают лучом, их траектории регистрируют по рассеянному свету и броуновскому движению, определяют среднюю скорость и коэффициент диффузии, после чего математически рассчитывают концентрацию и распределение экзосом по размерам^[19];③ Использование иммуноблоттинга (Western Blot) для выявления специфических белков на поверхности экзосомmarker ^[20]。

1.2.3 Основные показатели наблюдения

①просвечивающей электронной микроскопииНаблюдение морфологии экзосом из адипозных стволовых клеток;②анализ отслеживания наночастиц,определение размера и концентрации экзосом;③ идентификация экспрессируемых белков экзосом из адипозных стволовых клеток методом иммуноблоттинга.

2 Результаты

2.1 Морфология адипозных стволовых клеток

Рисунок3（a) — промытый и очищенный жир, рис.3（b）— морфология человеческих адипозных стволовых клеток третьего поколения под инвертированным микроскопом: клетки имеют удлинённую веретенообразную форму.

2.2 Результаты идентификации экзосом с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Как показано на рис.4（a),под просвечивающим электронным микроскопом размер экзосом из адипозных стволовых клеток составлял30nm-200nm, а форма была типичной для экзосом — округлой, чашевидной.

2.3 Результаты идентификации белковых маркеров экзосом методом иммуноблоттинга

Согласно стандарту Международного общества внеклеточных везикул^[21], везикула может считаться экзосомой только при наличии эндосомальных или плазмолеммных белков экзосом и цитозольных белков, связанных с их секрецией, а также при исключении одного структурного компонента, не относящегося к экзосомам, либо распространённого цитоплазматического белка. Как показано на рис.4（b), методом иммуноблоттинга выявлена экспрессия плазмолеммного белка экзосомCD63、CD81и связанного с секрециейESCRTв составе белкового комплексаTSG101, тогда как белок аппарата ГольджиGM130практически не экспрессировался. Это подтверждает, что выделенный продукт содержит экзосомы высокой чистоты.

2.4 Результаты анализа отслеживания наночастиц экзосом

Как показано на рис.5Как показано, распределение размеров частиц, полученное методом отслеживания наночастиц, было сосредоточено в диапазоне30nm-200nm; полученная концентрация частиц соответствует характерным размерам экзосом^[22]。

Рисунок3 Экспериментальный материал. (a) Жировая ткань, использованная в эксперименте; (b) морфология человеческих адипозных стволовых клеток

Fig.3 Experimental materials.(a)Fat used in experiments；(b)Morphology of human adipose stem cells

Рисунок4 Морфология экзосом и идентификация специфических белков. (a) Морфологические характеристики экзосом по данным просвечивающей электронной микроскопии; (b) выявление экспрессии белков экзосом методом иммуноблоттинга

Fig.4 Exosome morphology and specific protein identification.(a)Morphological characteristics of exosomes displayed by transmission electron microscopy;(b)Western blotting to detect exosome protein expression

Рисунок5 Распределение размеров экзосом по данным NTA
Fig.5 NTA detection of exosome particle size distribution

3 Обсуждение

В эксперименте по оценке характеристик полностью автоматической установки многоступенчатой фильтрации для выделения экзосом исходным материалом служили аутологичные адипозные стволовые клетки. Клиническая ценность получения экзосом из них заключается в широкой доступности и простоте получения аутологичного жира, отсутствии реакции отторжения и удобстве применения. Кроме того,полностью автоматическая установка многоступенчатой фильтрации экзосом имеет бесконтактную конструкцию и замкнутый контур интеллектуального управления, эффективно снижает трудозатраты и позволяет получать чистые, незагрязнённые экзосомы, соответствующие клиническим требованиям.Результаты эксперимента показали, что после концентрирования экзосом из адипозных стволовых клеток, их выделения центрифугированием и идентификации тремя стандартными методами полученные микрочастицы являются экзосомами, а уровень загрязнения находится в пределах нормы. Это подтверждает, что полностью автоматическая установка фильтрации экзосом концентрирует экзосомсодержащую надосадочную жидкость, а разделение концентрата позволяет получить целые экзосомы. Время обработки значительно меньше, чем при традиционных методах, и соответствует требованиям клинического применения.

Установка обеспечивает точное фракционированное выделение субпопуляций экзосом по размеру частиц (30-150nm), служит ценным инструментом для изучения взаимосвязи структуры и функции субпопуляций экзосом и предоставляет быстрый, эффективный и малотрудоёмкий метод для клинической терапии. В настоящее время установка всё ещё имеет некоторые недостатки: часть экзосом прилипает к фильтрующей мембране, что приводит к потере продукта и активности. В дальнейших исследованиях установка будет усовершенствована с применением новых методов, например тангенциальной фильтрации, чтобы устранить этот недостаток, сократить потери концентрата и повысить выход экзосом.

4 Заключение

Полностью автоматическая система многоступенчатой фильтрации обеспечивает быстрое и эффективное разделение экзосом, отвечает требованиям клинического применения и служит надёжной основой для лечения заболеваний с использованием экзосом.

Литература

[1] Raposo G,Stoorvogel W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.[J]. The Journal of cell biology,2013,200(4).

[2] Lee Y,El A S,Wood MJA. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.[J]. Human molecular genetics,2012,21(R1).

[3] Marqués-García F,Isidoro-García M. Protocols for Exosome Isolation and RNA Profiling.[J]. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.),2016,1434.

[4] Li P,Kaslan M,Lee SH,et al. Progress in exosome isolation tech-niques[J]. Theranostics,2017,7( 3) : 789-804.

[5] Clark DJ,Fondrie WE,Liao Z,et al. Redefining the breast cancer exosome proteome by tandem mass tag quantitative proteomics and m*riate cluster analysis[J]. Anal Chem,2015,87(20) : 10462-10469.

[6] Yu B,Zhang X,Li X. Exosomes derived from mesenchymal stem cell[J]. Int J Mol Sci,2014,15(3) : 4142-4157.

[7] Ye Dongman,Yu Tao. Выделение и идентификация опухолевых экзосом[J]. Современная онкологическая медицина,2018,26(20),3341-3343.

[8] Chan BD，Wong WY,Lee MM,et al. Exosomes in inflammation and inflammatory disease[J]. Proteomics,2019,13: e1800149.

[9] MATHIEU M, MARTIN-JAULAR L, LAVIEU G, et al. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication [J]. Nat Cell Biol, 2019, 21(1): 9-17.

[10] SHU S, YANG Y, ALLEN C L, et al. Purity and yield of melanoma exosomes are dependent on isolation method [J]. J Extracell Vesicles, 2020, 9(1): 1692401.

[11] Shi MM, Yang QY, Monsel A, et al. Preclinical efficacy and clinical safety of clinical-grade nebulized allogenic adipose mesenchymal stromal cells-derived extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2021;10(10):e12134.

[12] Zhao L, Gu C, Gan Y, Shao L, Chen H, Zhu H. Exosome-mediated siRNA delivery to suppress postoperative breast cancer metastasis. J Control Release. 2020;318:1-15.

[13] Jiang WJ, Xu CT, Du CL, et al. Tubular epithelial cell-to-macrophage communication forms a negative feedback loop via extracellular vesicle transfer to promote renal inflammation and apoptosis in diabetic nephropathy. Theranostics. 2022;12(1):324-339.

[14] Jiang L, Fei H, Jin X, et al. Extracellular Vesicle-Mediated Secretion of HLA-E by Trophoblasts Maintains Pregnancy by Regulating the Metabolism of Decidual NK Cells. Int J Biol Sci. 2021;17(15):4377-4395.

[15] WEN S W, LIMA L G, LOBB R J, et al. Breast cancer-derived exosomes reflect the cell-of-origin phenotype [J]. Proteomics, 2019, 19(8): e1800180.

[16] Yang Dongbin,Zhang Weihong,Zhang Huanyun,Zhang Fengqiu,Chen Lanmei,Ma Lixia,Larcher Leon M,Chen Suxiang,Liu Nan,Zhao Qingxia,Tran Phuong H L,Chen Changying,Veedu Rakesh N,Wang Tao. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.[J]. Theranostics,2020,10(8).

[17] Bai Jun,Ren Jun,Wang Jun,Zhang Hongmei,Yang Jingyue,Zhang Liwang.Экспериментальное исследование выделения экзосом методом центрифугирования и фильтрации[J].Журнал Четвёртого военно-медицинского университета,2004(10):890-892.

[18] Lässer C,Eldh M,Lötvall J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.[J]. Journal of visualized experiments : JoVE,2012(59).

[19] Xiao-Xia Yang,Chao Sun,Lei Wang,Xiu-Li Guo. New insight into isolation, identification techniques and medical applications of exosomes[J]. Journal of Controlled Release,2019,308(C).

[20] Théry C,Amigorena S,Raposo G,Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.[J].Current protocols in cell biology,2006,Chapter 3(1).

[21] Théry C, Witwer KW, Aikawa E, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018;7(1):1535750. Published 2018 Nov 23. doi:10.1080/20013078.2018.1535750

[22] Wang Shuai,Li Chaoran,Zhang Qianru,Huang Guilin.Выделение и идентификация экзосом из стволовых клеток мочи человека[J].Исследования тканевой инженерии Китая,2022,26(13):2056-2061.