Separazione esomatica completamente automatizzata utilizzando la filtrazione multistadio e la valutazione delle prestazioni

Uno strumento di filtrazione multistadio completamente automatizzato per la separazione degli esomi è stato sviluppato e le sue prestazioni valutate estraendo esomi derivati dalle cellule staminali autologhe umane.Metodi：Definire il processo di separazione dello strumento, progettare la sua struttura e lo sviluppo completo di hardware e software;ottenere tessuto adiposo autologo da pazienti, digerirlo per isolare le cellule staminali adipose, e la cultura e passare le cellule. Raccogliere la cultura supernatant da cellule staminali adipose di terzo passaggio e eseguire la centrifugazione preliminare. Aggiungere il tant di supernaal serbatoio del primo stadio e filtrarlo con lo strumento, quindi centrifugare il filtrato del terzo stadio per estrarre gli esomi. Usomicroscopio elettronico di trasmissione（Transmission Electron Microscope，TEM) osservare la morfologia esomatica ed eseguire analisi di tracciamento delle nanoparticelle (Nanoparticle Tracking Analysis，NTA），per analizzare le dimensioni e la concentrazione delle particelle e utilizzare la blotting occidentale (Western Blot) per rilevare l'espressione di proteine specifiche per esomi derivati da cellule adipose-stem-cellule. I marcatori di espressione includonoCD63、CD81、TSG101, pur rilevandoGM130per determinare il grado di contaminazione della vescicola nel campione testato.Risultati：Completato ilsviluppo dello strumento completamente automatizzato multistadio-filtrazione exosome-separation. Esomi derivati da cellule adipose ottenuti dopo la filtrazione, la concentrazione e la centrifugazione sono apparsi rotondi e cupformi sotto la microscopia elettronica di trasmissione. L'analisi di monitoraggio nanoparticella ha dimostrato che la maggior parte degli esomi erano all'interno50nm-200nm; Western blotting ha mostrato che gli esomi estratti espressiCD63、CD81、TSG101, con un rendimento esotico che raggiunge75%, e la contaminazione della vescicola all'interno della gamma normale.Conclusioni：Lo strumento di filtrazione multistadio completamente automatizzato separa gli esomi in modo rapido ed efficiente, soddisfa i requisiti per l'applicazione clinica e fornisce un forte supporto per il trattamento clinico delle malattie a base di esosoma.

Parole chiave:esomi; cellule staminali adipose; filtrazione; concentrazione; estrazione

Multistage Filtration Based Fully Automated Exosomes Separation Instrument and Its Performance Evaluation

Zeng Yangtian¹ Zheng Yi² Liu Kai^2* Li Hong^1*

1(Hangzhou Baiqiao Medical Technology Co.,Ltd., Hangzhou 310018)

2 (Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011)

3 (EVERFINE Test and Calibration Technology Co., Ltd, Hangzhou, Hangzhou 310053)

Abstract: Objective: to develop a fully automated multistage filtration instrument for the separation of exosomes and to evaluate the performance by extracting human autologous adipose-derived stem cells(ADSCs) exosomes. Methods: To determine the instrument separation process, design the instrument structure and complete the instrument development of both hardware and software; to obtain and digest the autologous fat from patients, obtain and subculture the adipose-derived stem cells, collect the supernatant of the third generation adipose-derived stem cell culture and make initial centrifugation, add the supernatant to the first reservoir then filter through the instrument, centrifuge the obtained third stage filtrate and extract exosomes. The morphology of the exosomes was observed by Transmission Electron Microscope (TEM). Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) was performed to analyze particle size and concentration. Western Blot (WB)was used to detect the specific protein expression of the adipose-derived stem cells exosomes, which including CD63, CD81, TSG101 and GM130.And the Western Blot Method also was used to detect the contamination extent of vesicles in the assay samples. Results: The development of a fully automated multistage filtration and separation instrument for exosomes was completed. The adipose-derived stem cell exosomes, which extracted by the instrument after filtration and concentration and centrifugation, were observed in a circular-cup shape by TEM. Most of the exosomes obtained by NTA were in the range of 50 nm-200 nm. WB showed that the extracted exosomes contained the expression of CD63, CD81, TSG101 and CD81. Exosomes were obtained up to 75% and vesicle contamination was within the normal range. Conclusion: The fully automated multistage filtration and separation of exosomes instrument can achieve efficient and rapid separation of exosomes, which meets the requirements of clinical application and provides a strong support for clinical exosomes in disease treatment.

Keywords: Exosomes; Adipose-Derived Stem Cells; Filtration; Concentration; Extraction

Introduzione

Exosomes (in inglese)exosome) sono vescicole extracellulari con diametri30～150nmVescicole extracellulari^[1-3]; studi^[4-8]mostrare che gli esomi sono ampiamente presenti nei fluidi del corpo come urina, effusioni pleurali e peritoneali, latte e saliva. Molti tipi di cellule possono secrete esomi, tra cuiMSCs, cellule del sangue, cellule endoteliali, neuroni e cellule tumorali. Gli esomi portano ampie informazioni biologiche intracellulari ed extracellulari, agiscono come mediatori della comunicazione cellulare e rimodellamento della matrice extracellulare, e sono strettamente legati alla salute umana e alla malattia^[9-10]，attraverso l'inalazione di aerosolMSC-EVscome un percorso di amministrazione ha un significato importante per il trattamento della sindrome di stress respiratorio acuto^[11]; Zhu Hongyan’s^[12]gruppo di ricerca ha mostrato che:CBSA/siS100A4può inibire significativamente la crescita delle cellule tumorali maligne;^[13]il team ha rivelato che il cross-talk intermedio tra cellule epiteliali tubolari renali e macrofagi gioca un ruolo importante nel trattamento della nefropatia diabetica;^[14]squadra trovato che regolazione deciduoNKil metabolismo cellulare (maternal) migliora così il decidualNKsecrezione cellulare di fattori necessari per lo sviluppo placentare.Poiché il valore degli esomi nella diagnosi clinica, il trattamento delle malattie e la rigenerazione dei tessuti è diventato sempre più evidente negli ultimi anni, i ricercatori in tutto il mondo hanno studiato le loro proprietà e la loro struttura distintive in una profondità sempre maggiore.

I metodi tradizionali di esosome-separazione includono ultracentrifugazione, filtrazione, perline immunomagnetiche e chip microfluidici^[15]. Ultracentrifugazione è difficile da adottare ampiamente perché la sua attrezzatura è costosa. Perle immunomagnetiche introducono componenti esteri che limitano l'uso clinico. I chip microfluidici raggiungono elevata purezza di separazione ma producono rese molto piccole e sono difficili da scalare. Anche se la filtrazione è matura, è attualmente eseguita manualmente, rendendola laboriosa, che richiede tempo e soggetta a contaminazione^[16-17]。

Questo studio migliora il metodo di filtrazione, ottimizza le dimensioni e le fasi dei pori di filtrazione e sviluppa il controllo intelligente dell'intero processo per soddisfare i requisiti clinici per un uso efficiente, rapido e sicuro. La performance exosome-preparation dello strumento è stata poi valutata sperimentalmente.

1 Metodi

1.1 Progettazione dello strumento

1.1.1 Configurazione degli strumenti

Lo strumento è costituito da due serbatoi, un'unità di filtrazione multistadio, un motore, una pompa pistone, due sensori di pressione, un motore, un meccanismo di movimento lineare, un touchscreen e altri componenti (Figura1). L'intero sistema è controllato daPLCe un modulo di acquisizione dati. Le letture dei sensori di pressione vengono visualizzate sul touchscreen in tempo reale e il touchscreen fornisce l'interfaccia uomo-macchina. Lo strumento offre modalità automatiche e manuali, che possono essere selezionate per lo scenario operativo.

1.1.2 Flusso di lavoro dello strumento

Il processo di concentrazione di un liquido bersaglio con lo strumento è mostrato in Figura2: il liquido viene aggiunto al Conservatorio 1 e la potenza è attivata. Il controller gestisce l'azionamento del motore, che inizia e ferma il motore. Quando il motore funziona, il meccanismo di movimento lineare guida la pompa del pistone. Un tubo di aspirazione disegna liquido da Reservoir 1 e lo invia attraverso la tubazione all'unità di filtrazione multistadio. I sensori di pressione sono installati all'ingresso e all'uscita dell'unità per misurare in tempo realela differenza tra le letture dei sensori di pressione nelle camere di stabilizzazione della pressione del primo e del secondo stadio. Il tempo di accensione/spegnimento della pompa viene regolato in base a tale differenza, mantenendo una pressione differenziale costante attraverso l'unità di filtrazione multistadio. Questo spinge il liquido attraverso l'unità di filtrazione multistadio, filtrando automaticamente le particelle per diametro. Alla fine di una corsa, le particelle più piccole della dimensione del poro della membrana più bassa dell'unità e il liquido di scarico vengono scaricati attraverso la linea terminale in Reservoir 2. I ricercatori possono raccogliere il prodotto desiderato dalla fase appropriata dell'unità di filtrazione.

Figura1 Exosome completamente automatizzatoIsolamento e concentrazioneStrumento

Fig.1 Automatic Exosome Filtration Instrument

Figura2 Schema del flusso di lavoro dello strumento

Fig.2 Instrument work flow chart

1.2 Valutazione delle prestazioni degli strumenti

1.2.1 Materiali sperimentali

1.2.11 Reagenti sperimentali principali (1.2.1.1)

adipose stelo-cell cultura supplemento (UltraGRO^TM，AventaCell BioMedical, USA);PBS（Gibco, USA)；0.25%Provenienza (Gibco, USA); siero bovino fetale (Gibco, USA); soluzione tripla antibiotica (Gibco，USA);α-MEM, basso glucosio e alto glucosiDMEM（Gibco, USA); collagene (Collagenase NB4，Serva, Germania); BCAkit di analisi proteica (Beyotime, Cina).

1.2.1.2Principali strumenti sperimentali

sterile monouso10 cmpiatti di cultura (BD, USA)；100 kDatubi di ultrafiltrazione (Milipore, USA)；panca pulita (Suzhou Purification Equipment Co., Ltd., Cina); lettore microplate (Thermo Fisher Scientific, USA)；bilancia elettronica di precisione (Longcheng Instrument Equipment Co., Ltd., Cina); citometro di flusso (Beckman，USA)；centrifuga da banco regolabile a temperatura(Thermo Fisher Scientific, Stati Uniti);emocitometro (Shanghai Qiujing Biochemical Reagent Instrument Co., Ltd., Cina)；shaker a temperatura regolabile (Taicang Huamei Biochemical Instrument Factory, Cina)；bagno acquatico a temperatura costante (Shanghai Hetian Scientific Instruments Co., Ltd., Cina).

1.2.2 Metodi sperimentali

1.2.2.1Isolamento e cultura delle cellule staminali adipose

Il tessuto adiposo in questo studio è venuto dall'addome o la coscia interna ed è stato scartato tessuto dopo che i pazienti hanno subito liposuzione. Tutti i pazienti hanno firmato moduli informativi-consenso che accettano di donare il tessuto scartato per la ricerca medica. Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico di Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.

Dopo che il tessuto adiposo donato è stato ottenuto, è stato digerito con collagenasi e centrifugato per isolare le cellule staminali adipose primarie. Le cellule sono state seminateα-MEMcultura media contenente10cmpiatti di cultura e cultura a5%CO₂，37°C. Quando le cellule si avvicinano80%-90%confluenza, una soluzione contenenteEDTAdi0.25%Passare le celle con la digestione di Trypsin. Usa il passaggio3cellule staminali adipose-derivate per estrazione esomatica.

1.2.2.2Estrazione di esomi di cellule staminali adipose

Trasferire il passaggio raccolto3adipose-derived staminale supernatant nel serbatoio di ingresso dell'esosome estrattore e filtrarlo con lo strumento. Aggiungere il filtrato raccolto ad un100kDadimiliporetubo di ultrafiltrazione per estrarre esomi da ultrafiltrazione. Centrifughe a3000g，15-20min，4°C fino a quasi tutto supernatant nel tubo di ultrafiltrazione interno è passato attraverso, quindi utilizzarePBSlavare una volta e centrifugare fino solo200-500μLdi esospezionePBS. Dopo la centrifugazione, aspirare l'esosome-contenentePBSe conservare in4°C in un frigorifero.

1.2.2.3Identificazione degli esomi delle cellule staminali adipose

Con i metodi di separazione attuali, è difficile ottenere esomi eccezionalmente puri e omogenei. Gli esomi ottenuti mediante centrifugazione del campione concentrato dello strumento devono quindi essere identificati. Questo studio ha utilizzato tre metodi di identificazione secondo gli standard stabiliti dalla International Society for Extracellular Vesicles per garantire l'accuratezza.1 microscopia elettronica di trasmissione (TEM) osservare la morfologia degli esomi pretrattati^[18];2 Analisi di tracciamento nanoparticella basata su dimensioni (NTA): un fascio luminoso illumina le particelle nel campione esomatico, e la traiettoria di ciascuna particella è registrata dalla sua luce sparsa e dal movimento Browniano. La velocità media e il coefficiente di diffusione possono quindi essere determinati e utilizzati nei calcoli matematici per ottenere la concentrazione esosmica e la distribuzione delle dimensioni^[19];3 Western blotting (Western Blot) per rilevare proteine superficiali specifiche dell'esosomemarker ^[20]。

1.2.3 endpoint di osservazione primaria

①microscopio elettronico di trasmissioneOsservare la morfologia degli esomi di cellule staminali adipose-derivate;②analisi di monitoraggio delle nanoparticelle,analisi per determinare le dimensioni e la concentrazione delle particelle esomatiche;3 Western blot identificazione di proteine espresse da esomi di cellule staminali adipose-derivati.

2 Risultati

2.1 morfologia delle cellule staminali adipose

Figura3（a) mostra tessuto adiposo lavato e purificato; Figura3（b）mostra cellule staminali adipose derivate da un terzo passaggio con una lunga morfologia a forma di mandrino sotto un microscopio invertito.

2.2 Identificazione della microscopia elettronica di trasmissione di esomi

Come mostrato in Figura4（a),sotto la microscopia dell'elettrone di trasmissione, esomi delle cellule staminali adipose-derivati misurati30nm-200nme ha esposto la tipica morfologia rotonda a forma di coppa.

2.3 Western blot identificazione di marcatori esoosome

Sotto la International Society for Extracellular Vesicles standard^[21], una vescicola può essere chiamata esoma solo se contiene una proteina endosomica o esomica plasma-membrana e una proteina citosolica associata a secrezione esomatica, escludendo al contempo una proteina strutturale non esomica o proteina citosolica ampiamente distribuita. Come mostrato in Figura4（b), Western blotting ha rilevato l'espressione della proteina esomica plasma-membranaCD63、CD81e la secrezione associataESCRTproteina complessaTSG101, mentre la proteina GolgiGM130era scarsamente espresso, dimostrando che il prodotto isolato conteneva esomi di purezza relativamente elevata.

2.4 Analisi di tracciamento nanoparticella degli esomi

Come mostrato in Figura5mostra che l'analisi di tracciamento nanoparticella ha trovato la distribuzione delle particelle da concentrare tra30nm-200nm; la concentrazione e le dimensioni delle particelle erano coerenti con le caratteristiche esomatiche^[22]。

Figura3 Materiali sperimentali. (a) tessuto adiposo utilizzato nell'esperimento; (b) Morfologia delle cellule staminali derivate dall'uomo

Fig.3 Experimental materials.(a)Fat used in experiments；(b)Morphology of human adipose stem cells

Figura4 morfologia esomatica e identificazione specifica-proteina. (a) morfologia esomatica mostrata dalla microscopia elettronica di trasmissione; (b) rilevamento Western blot dell'espressione proteica esosoma

Fig.4 Exosome morphology and specific protein identification.(a)Morphological characteristics of exosomes displayed by transmission electron microscopy;(b)Western blotting to detect exosome protein expression

Figura5 Distribuzione delle particelle esotiche misurata da NTA
Fig.5 NTA detection of exosome particle size distribution

3 Discussione

La valutazione delle prestazioni del separatore esomatico multistadio-filtrazione completamente automatizzato utilizzato celle staminali autologo-derivate adipose come materia prima. Il significato clinico dell'estrazione di esomi da cellule staminali autologo adipose-derivate è che il tessuto adiposo autologo è abbondante e facile da ottenere, non provoca alcun rifiuto, ed è conveniente da usare. Inoltre, ilIl separatore esotico multistadio-filtrazione completamente automatizzato utilizza un design non-contatto con controllo intelligente a ciclo chiuso, riducendo efficacemente i costi del lavoro e producendo esomi ad alta purezza, senza contaminazione che soddisfano i requisiti clinici.La valutazione sperimentale ha dimostrato che dopo la concentrazione e l'estrazione centrifuga di esomi di cellule staminali adipose-derivate, tutti e tre i metodi di identificazione standard hanno confermato che le microparticelle estratti erano esomi e che la contaminazione era all'interno della gamma normale. Ciò dimostra che lo strumento di filtrazione esomatica completamente automatizzato può filtrare e concentrare gli esomi contenenti supernatant e isolare gli esomi intatti dal concentrato. Il tempo di lavorazione richiesto è molto più breve rispetto ai metodi di estrazione tradizionali e soddisfa i requisiti di applicazione clinica.

Lo strumento completato può precisamente separare le sottopopolazioni esomatiche dalle dimensioni delle particelle (30-150nm), fornendo uno strumento prezioso per studiare il rapporto tra la struttura e la funzione delle sottopopolazioni esomatiche e un metodo veloce, efficiente, di risparmio di lavoro per il trattamento clinico. Lo strumento ha ancora alcune limitazioni: alcuni esomi aderiscono alla membrana del filtro, causando la perdita del prodotto e l'attività ridotta. La ricerca futura migliorerà ulteriormente l'esomatore adottando nuovi metodi di filtrazione come il flusso tangenziale per affrontare questa limitazione, ridurre i rifiuti concentrati e aumentare la resa esomatica.

4 Conclusioni

Lo strumento di filtrazione multistadio completamente automatizzato separa gli esomi in modo rapido ed efficiente, soddisfa i requisiti per l'applicazione clinica e fornisce un forte supporto per il trattamento clinico delle malattie a base di esosoma.

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