Separación Exosome totalmente automatizada usando Filtración multietapa y evaluación de rendimiento

Se desarrolló un instrumento de filtración multietapa totalmente automatizado para separar los exosomas y se evaluó su rendimiento mediante la extracción de exosomas derivados de células madre humanas autólogas.Métodos：Definir el proceso de separación del instrumento, diseñar su estructura y completo desarrollo de hardware y software;obtener tejido adiposo autólogo de los pacientes, digerirlo para aislar células madre adiposas, y cultura y paso de las células. Recoge la cultura supernatant de células madre adiposas de tercer paso y realizar centrifugación preliminar. Añadir el supernatant al embalse de primera etapa y filtrarlo con el instrumento, luego centrifugar el filtro de tercera etapa para extraer exosomas. Usotransmisión microscopía electrónica（Transmission Electron Microscope，TEM) para observar la morfología exosome y realizar análisis de seguimiento de nanopartículas (Nanoparticle Tracking Analysis，NTA），para analizar el tamaño y la concentración de partículas, y utilizar Western blotting (Western Blot) para detectar la expresión de proteínas específicas a los exosomas de células-adiposas. Los marcadores de expresión incluyenCD63、CD81、TSG101, mientras que también detectaGM130para determinar el grado de contaminación vesical en la muestra probada.Resultados：Completadodesarrollo del instrumento de eliminación de exosome-separación multietapa totalmente automatizado. Exosomas de células de adipose-stem obtenidos después de la filtración, concentración y centrifugación aparecieron redondos y en forma de copa bajo microscopía electrónica de transmisión. Análisis de seguimiento de nanopartículas mostró que la mayoría de los exosomas estaban dentro50nm-200nm; Western blotting mostró que los exosomas extraídos expresadosCD63、CD81、TSG101, con un rendimiento exosome alcanzando75%, y la contaminación de vesículas dentro del rango normal.Conclusión：El instrumento de filtración multietapa completamente automatizado separa los exosomas de forma rápida y eficiente, cumple con los requisitos para la aplicación clínica y proporciona un fuerte apoyo para el tratamiento clínico de enfermedades exosome.

Palabras clave:exosomas; células madre adiposas; filtración; concentración; extracción

Multistage Filtration Based Fully Automated Exosomes Separation Instrument and Its Performance Evaluation

Zeng Yangtian¹ Zheng Yi² Liu Kai^2* Li Hong^1*

1(Hangzhou Baiqiao Medical Technology Co.,Ltd., Hangzhou 310018)

2 (Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011)

3 (EVERFINE Test and Calibration Technology Co., Ltd, Hangzhou, Hangzhou 310053)

Abstract: Objective: to develop a fully automated multistage filtration instrument for the separation of exosomes and to evaluate the performance by extracting human autologous adipose-derived stem cells(ADSCs) exosomes. Methods: To determine the instrument separation process, design the instrument structure and complete the instrument development of both hardware and software; to obtain and digest the autologous fat from patients, obtain and subculture the adipose-derived stem cells, collect the supernatant of the third generation adipose-derived stem cell culture and make initial centrifugation, add the supernatant to the first reservoir then filter through the instrument, centrifuge the obtained third stage filtrate and extract exosomes. The morphology of the exosomes was observed by Transmission Electron Microscope (TEM). Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) was performed to analyze particle size and concentration. Western Blot (WB)was used to detect the specific protein expression of the adipose-derived stem cells exosomes, which including CD63, CD81, TSG101 and GM130.And the Western Blot Method also was used to detect the contamination extent of vesicles in the assay samples. Results: The development of a fully automated multistage filtration and separation instrument for exosomes was completed. The adipose-derived stem cell exosomes, which extracted by the instrument after filtration and concentration and centrifugation, were observed in a circular-cup shape by TEM. Most of the exosomes obtained by NTA were in the range of 50 nm-200 nm. WB showed that the extracted exosomes contained the expression of CD63, CD81, TSG101 and CD81. Exosomes were obtained up to 75% and vesicle contamination was within the normal range. Conclusion: The fully automated multistage filtration and separation of exosomes instrument can achieve efficient and rapid separation of exosomes, which meets the requirements of clinical application and provides a strong support for clinical exosomes in disease treatment.

Keywords: Exosomes; Adipose-Derived Stem Cells; Filtration; Concentration; Extraction

Introducción

Exosomasexosome) son vesículas extracelulares con diámetros de30～150nmvesículas extracelulares^[1-3]; estudios^[4-8]mostrar que los exosomas están ampliamente presentes en fluidos corporales como la orina, las derrames pleurales y peritoneales, la leche y la saliva. Muchos tipos de células pueden secretar exosomas, incluyendoMSCs, células sanguíneas, células endoteliales, neuronas y células tumorales. Los exosomas llevan extensa información biológica intracelular y extracelular, actúan como mediadores de comunicación celular y remodelación extracelular-matrix, y están estrechamente vinculados a la salud y la enfermedad humanas^[9-10]，por inhalación de aerosolMSC-EVscomo una ruta de administración tiene gran importancia para tratar el síndrome de dificultad respiratoria aguda^[11]; Zhu Hongyan^[12]El grupo de investigación mostró que:CBSA/siS100A4puede inhibir significativamente el crecimiento de células malignas del cáncer de mama; Ma Taotao^[13]equipo reveló que la radiografía mediada por exosome entre las células epiteliales tubulares renales y los macrófagos juega un papel importante en el tratamiento de la nefropatía diabética; Zhang Songying^[14]el equipo encontró que la regulación deNKmetabolismo celular (maternal) mejora asíNKsecreción celular de los factores necesarios para el desarrollo placentero.Como el valor de los exosomas en el diagnóstico clínico, el tratamiento de enfermedades y la regeneración de tejidos se ha hecho cada vez más evidente en los últimos años, los investigadores de todo el mundo han estudiado sus propiedades y estructura distintivas en mayor profundidad.

Los métodos tradicionales de separación exosome incluyen ultracentrifugación, filtración, cuentas inmunomagnéticas y chips microfluídicos^[15]La ultracentrifugación es difícil de adoptar ampliamente porque su equipo es caro. Las cuentas inmunomagnéticas introducen componentes extranjeros que limitan el uso clínico. Los chips microfluídicos logran una alta pureza de separación pero producen rendimientos muy pequeños y son difíciles de escalar. Aunque la filtración es madura, se realiza manualmente, lo que lo hace mano a mano, consume mucho tiempo y propenso a la contaminación^[16-17]。

Este estudio mejora el método de filtración, optimiza los tamaños y etapas de los poros de filtración y desarrolla un control inteligente de todo el proceso para satisfacer los requisitos clínicos para un uso eficiente, rápido y seguro. El rendimiento exosome-preparation del instrumento fue evaluado experimentalmente.

1 Métodos

1.1 Diseño de instrumentos

1.1.1 Configuración general de instrumentos

El instrumento consta de dos depósitos, una unidad de filtración multietapa, una unidad de motor, una bomba de propulsión, dos sensores de presión, un motor, un mecanismo de movimiento lineal, una pantalla táctil y otros componentes (Figura)1). Todo el sistema está controlado porPLCy un módulo de adquisición de datos. Las lecturas de sensor de presión se muestran en la pantalla táctil en tiempo real, y la pantalla táctil proporciona la interfaz humana-máquina. El instrumento ofrece modos automáticos y manuales, que se pueden seleccionar para el escenario operativo.

1.1.2 Instrumento de flujo de trabajo

El proceso para concentrar un líquido objetivo con el instrumento se muestra en la Figura2: líquido se añade al Reservoir 1 y la potencia se activa. El controlador opera la unidad de motor, que comienza y detiene el motor. Cuando el motor funciona, el mecanismo de movimiento lineal conduce la bomba de émbolo. Un tubo de succión saca líquido de Reservoir 1 y lo envía a través de la tubería a la unidad de filtración multietapa. Los sensores de presión se instalan en la entrada y salida de la unidad para medir en tiempo realla diferencia entre lecturas de sensor de presión en las cámaras estabilizadoras de presión de primera y segunda etapa. El tiempo de encendido/apagado de la bomba de émbolo se ajusta según esa diferencia, manteniendo una presión diferencial constante a través de la unidad de filtración multietapa. Esto conduce líquido a través de la unidad de filtración multietapa, filtrando automáticamente partículas por diámetro. Al final de una carrera, las partículas más pequeñas que el tamaño poro de la membrana más baja de la unidad y el líquido de desecho se descargan a través de la línea terminal en Reservoir 2. Los investigadores pueden recoger el producto deseado desde la etapa apropiada de la unidad de filtración.

Gráfico1 Exosome totalmente automatizadoIsolación y concentraciónInstrumento

Fig.1 Automatic Exosome Filtration Instrument

Gráfico2 Diagrama de flujo de trabajo de instrumentos

Fig.2 Instrument work flow chart

1.2 Evaluación de la actuación profesional

1.2.1 Materiales experimentales

1.2.1.1 Reagentes experimentales principales

suplemento de cultivo de células madre adiposas (UltraGRO^TM，AventaCell BioMedical, USA);PBS（Gibco, USA)；0.25%TrypsinGibco, USA); fetal bovine serum (Gibco, EE.UU.); solución triple antibiótico (Gibco，USA);α-MEM, baja englucosa y alta englucosaDMEM（Gibco, USA); collagenase (Collagenase NB4，Serva- Alemania); BCAkit de ensayo de proteínas (Beyotime, China).

1.2.1.2Principales instrumentos experimentales

estéril desechable10 cmplatos de culturaBD, USA)；100 kDatubos de ultrafiltración (Milipore, USA)；banco limpio (Suzhou Purification Equipment Co., Ltd., China); lector de microplatosThermo Fisher Scientific, USA)；balance electrónico de precisión (Longcheng Instrument Equipment Co., Ltd., China); cistómetro de flujo (China);Beckman，USA)；centrifugador de presión ajustable(Thermo Fisher Scientific, USA);hemocytometer (Shanghai Qiujing Biochemical Reagent Instrument Co., Ltd., China)；agitador ajustable de temperatura (Taicang Huamei Biochemical Instrument Factory, China)；baño de agua de temperatura constante (Shanghai Hetian Scientific Instruments Co., Ltd., China).

1.2.2 Métodos experimentales

1.2.2.1Isolación y cultura de células madre adiposas

El tejido adiposo en este estudio vino del abdomen o del muslo interno y fue descartado tejido después de que los pacientes sufrieran liposucción. Todos los pacientes firmaron formularios de consentimiento informado aceptando donar el tejido descartado para la investigación médica. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Popular del Noveno de Shanghai, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.

Después de obtener el tejido adiposo donado, fue digerido con collagenasa y centrifugado para aislar células madre de adiposo primario. Las células estaban sembradasα-MEMmedio cultural que contiene10cmplatos culturales y cultivados en5%CO₂，37°C. Cuando las células se acercaron80%-90%confluencia, solución que contieneEDTAde0.25%Pase las células por la digestión de trippsia. Uso pasaje3células madre adipose-derivadas para la extracción exosome.

1.2.2.2Extracción de exosomas de células madre de origen adiposo

Transferir el pasaje recogido3adipose-derivada célula madre supernatant en el embalse de entrada del extractor exosome y filtrarlo con el instrumento. Añadir el filtro recogido a un100kDademiliporetubo de ultrafiltración para extraer exosomas por ultrafiltración. Centrifuge en3000g，15-20min，4°C hasta que casi todo supernatant en el tubo de ultrafiltración interior ha pasado a través, luego utilizarPBSpara lavar una vez y centrífuga hasta que sólo200-500μLof exosome-containingPBS. Después de la centrifugación, aspirar al exosome-containingPBSy almacenar en4°C en un refrigerador.

1.2.2.3Identificación de exosomas de células madre de origen adiposo

Con métodos de separación actuales, es difícil obtener exosomas excepcionalmente puros y homogéneos. Por lo tanto, es necesario identificar los exosomas obtenidos centrifugando la muestra centrada en el instrumento. Este estudio utilizó tres métodos de identificación de acuerdo con los estándares establecidos por la Sociedad Internapara Vesicles Extracelulares para garantizar la precisión.1 Microscopia de electrones de transmisiónTEM) para observar la morfología de exosomas pretratados^[18];2 Análisis de seguimiento de nanopartículas basado en tamaño (NTA): un rayo de luz ilumina partículas en la muestra exosome, y la trayectoria de cada partícula se registra a partir de su luz dispersa y movimiento Browniano. El coeficiente de velocidad media y difusión puede ser determinado y utilizado en cálculos matemáticos para obtener la concentración exosome y distribución de tamaño^[19];3 Western blottingWestern Blot) para detectar proteínas de superficie específicas exosomemarker ^[20]。

1.2.3 Puntos finales de observación primaria

①transmisión microscopía electrónicaObservar la morfología de los exosomas de células madre derivadas de la adiposa;②análisis de seguimiento de nanopartículas,análisis para determinar el tamaño y la concentración de partículas exosome;3 Western blot identification of proteins expressed by adipose-derived th cell exosomes.

2 Resultados

2.1 Morfología de células madre derivadas de la adiposa

Gráfico3（a) muestra tejido adiposo lavado y purificado; Figura3（b）muestra células madre adiposas humanas de terceros pasos con una morfología en forma de husillo bajo un microscopio invertido.

2.2 Transmission electron microscopy identification of exosomes

Como se muestra en la Figura4（a),bajo microscopía de electrones de transmisión, exosomas de células madre adiposas30nm-200nmy exhibió la típica morfología exosome en forma de copa.

2.3 Western blot identification of exosome markers

Bajo el estándar International Society for Extracellular Vesicles^[21], una vesícula se puede llamar un exosome solamente si contiene una proteína de plasma-membrana endosomal o exosomal y una proteína citosolica asociada con la secreción exosome, mientras que excluye una proteína estructural no exosomal o una proteína citosolica ampliamente distribuida. Como se muestra en la Figura4（b), Western blotting detectó la expresión de la proteína plasma-membrana exosomalCD63、CD81y la secreción asociadaESCRTproteína complejaTSG101, mientras la proteína GolgiGM130apenas se expresó, demostrando que el producto aislado contenía exosomas de pureza relativamente alta.

2.4 Análisis de seguimiento de nanopartículas de exosomas

Como se muestra en la Figura5muestra que el análisis de seguimiento de nanopartículas encontró que la distribución del tamaño de partículas se concentró entre30nm-200nm; la concentración de partículas y el tamaño eran consistentes con características exosome^[22]。

Gráfico3 Materiales experimentales.a) Tejido adiposo utilizado en el experimento; (b) Morfología de las células madre humanas derivadas de la adiposa

Fig.3 Experimental materials.(a)Fat used in experiments；(b)Morphology of human adipose stem cells

Gráfico4 Morfología exótica e identificación de proteína específica. (a) Morfología exótica mostrada por microscopía electrónica de transmisión; (b) Western blot de detección de exosome protein expression

Fig.4 Exosome morphology and specific protein identification.(a)Morphological characteristics of exosomes displayed by transmission electron microscopy;(b)Western blotting to detect exosome protein expression

Gráfico5 Distribución de tamaño de partículas exosome medida por NTA
Fig.5 NTA detection of exosome particle size distribution

3 Debate

La evaluación de rendimiento del separador exosome multietapa totalmente automatizado utilizó células madre autologosas de origen adiposo como materia prima. El significado clínico de extraer exosomas de células madre autologosas derivadas de la adiposa es que el tejido adiposo autológico es abundante y fácil de obtener, no causa rechazo, y es conveniente de usar. Además, elSeparador exosome de filtración multietapa completamente automatizado utiliza un diseño no-contacto con control de cierre inteligente, reduciendo eficazmente los costes laborales y produciendo exosomas libres de contaminación que cumplen con los requisitos clínicos.La evaluación experimental mostró que después de concentrarse y extraer centrífugamente exosomas de células madre derivadas de la adipose, los tres métodos de identificación estándar confirmaron que las micropartículas extraídas eran exosomas y que la contaminación estaba dentro del rango normal. Esto demuestra que el instrumento de filtración exosome totalmente automatizado puede filtrar y concentrar exosome-containing supernatant y aislar exosomas intactos del concentrado. El tiempo de procesamiento requerido es mucho más corto que con métodos de extracción tradicionales y cumple con los requisitos de aplicación clínica.

El instrumento completado puede precisamente separar subpoblaciones exosome por tamaño de partículas (30-150nm), proporcionando una herramienta valiosa para estudiar la relación entre la estructura y la función de las subpoblaciones exosome y un método rápido, eficiente, de ahorro de mano de obra para el tratamiento clínico. El instrumento todavía tiene algunas limitaciones: algunos exosomas se adhieren a la membrana del filtro, causando la pérdida del producto y la actividad reducida. La investigación futura mejorará aún más el extractor exoso adoptando nuevos métodos de filtración como el flujo tangencial para abordar esta limitación, reducir los residuos concentrados y aumentar el rendimiento exoso.

4 Conclusión

El instrumento de filtración multietapa completamente automatizado separa los exosomas de forma rápida y eficiente, cumple con los requisitos para la aplicación clínica y proporciona un fuerte apoyo para el tratamiento clínico de enfermedades exosome.

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