Séparation entièrement automatisée des exosomes par filtration multiétagée et évaluation des performances

Un instrument entièrement automatisé à filtration multiétagée destiné à séparer les exosomes a été développé, et ses performances ont été évaluées en extrayant des exosomes dérivés de cellules souches adipeuses autologues humaines.Méthodes：Définir le procédé de séparation de l’instrument, concevoir sa structure et achever le développement matériel et logiciel ;prélever du tissu adipeux autologue chez les patients, le digérer afin d’isoler les cellules souches adipeuses, puis cultiver et repiquer les cellules. Recueillir le surnageant de culture des cellules souches adipeuses au troisième passage et effectuer une centrifugation préliminaire. Ajouter le surnageant au réservoir de premier étage et le filtrer avec l’instrument, puis centrifuger le filtrat de troisième étage afin d’extraire les exosomes. Utiliserla microscopie électronique en transmission（Transmission Electron Microscope，TEM) pour observer la morphologie des exosomes et effectuer une analyse de suivi des nanoparticules (Nanoparticle Tracking Analysis，NTA），afin d’analyser la taille et la concentration des particules, et utiliser un Western blot (Western Blot) pour détecter l’expression des protéines spécifiques aux exosomes dérivés de cellules souches adipeuses. Les marqueurs d’expression comprennentCD63、CD81、TSG101, tout en détectant égalementGM130afin de déterminer le degré de contamination vésiculaire de l’échantillon testé.Résultats：Achèvement dudéveloppement de l’instrument entièrement automatisé de séparation des exosomes par filtration multiétagée. Après filtration, concentration et centrifugation, les exosomes dérivés de cellules souches adipeuses présentaient une forme ronde et cupuliforme en microscopie électronique en transmission. L’analyse de suivi des nanoparticules a montré que la plupart des exosomes se situaient dans la plage50nm-200nm; le Western blot a montré que les exosomes extraits exprimaientCD63、CD81、TSG101, avec un rendement en exosomes atteignant75%, et une contamination vésiculaire dans la plage normale.Conclusion：L’instrument entièrement automatisé à filtration multiétagée sépare les exosomes rapidement et efficacement, répond aux exigences des applications cliniques et apporte un soutien solide aux traitements cliniques des maladies fondés sur les exosomes.

Mots-clés :exosomes ; cellules souches adipeuses ; filtration ; concentration ; extraction

Multistage Filtration Based Fully Automated Exosomes Separation Instrument and Its Performance Evaluation

Zeng Yangtian¹ Zheng Yi² Liu Kai^2* Li Hong^1*

1(Hangzhou Baiqiao Medical Technology Co.,Ltd., Hangzhou 310018)

2 (Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011)

3 (EVERFINE Test and Calibration Technology Co., Ltd, Hangzhou, Hangzhou 310053)

Abstract: Objective: to develop a fully automated multistage filtration instrument for the separation of exosomes and to evaluate the performance by extracting human autologous adipose-derived stem cells(ADSCs) exosomes. Methods: To determine the instrument separation process, design the instrument structure and complete the instrument development of both hardware and software; to obtain and digest the autologous fat from patients, obtain and subculture the adipose-derived stem cells, collect the supernatant of the third generation adipose-derived stem cell culture and make initial centrifugation, add the supernatant to the first reservoir then filter through the instrument, centrifuge the obtained third stage filtrate and extract exosomes. The morphology of the exosomes was observed by Transmission Electron Microscope (TEM). Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) was performed to analyze particle size and concentration. Western Blot (WB)was used to detect the specific protein expression of the adipose-derived stem cells exosomes, which including CD63, CD81, TSG101 and GM130.And the Western Blot Method also was used to detect the contamination extent of vesicles in the assay samples. Results: The development of a fully automated multistage filtration and separation instrument for exosomes was completed. The adipose-derived stem cell exosomes, which extracted by the instrument after filtration and concentration and centrifugation, were observed in a circular-cup shape by TEM. Most of the exosomes obtained by NTA were in the range of 50 nm-200 nm. WB showed that the extracted exosomes contained the expression of CD63, CD81, TSG101 and CD81. Exosomes were obtained up to 75% and vesicle contamination was within the normal range. Conclusion: The fully automated multistage filtration and separation of exosomes instrument can achieve efficient and rapid separation of exosomes, which meets the requirements of clinical application and provides a strong support for clinical exosomes in disease treatment.

Keywords: Exosomes; Adipose-Derived Stem Cells; Filtration; Concentration; Extraction

Introduction

Les exosomes (exosome) sont des vésicules extracellulaires d’un diamètre de30～150nmvésicules extracellulaires^[1-3]; des études^[4-8]montrent que les exosomes sont largement présents dans les fluides corporels tels que l’urine, les épanchements pleuraux et péritonéaux, le lait et la salive. De nombreux types de cellules peuvent sécréter des exosomes, notammentMSCs, les cellules sanguines, les cellules endothéliales, les neurones et les cellules tumorales. Les exosomes transportent de nombreuses informations biologiques intracellulaires et extracellulaires, agissent comme médiateurs de la communication cellulaire et du remodelage de la matrice extracellulaire, et sont étroitement liés à la santé et aux maladies humaines^[9-10]，par inhalation d’aérosolMSC-EVscomme voie d’administration présente un intérêt majeur pour le traitement du syndrome de détresse respiratoire aiguë^[11]; le groupe de recherche de Zhu Hongyan^[12]a montré que :CBSA/siS100A4peut inhiber de manière significative la croissance des cellules malignes du cancer du sein ; l’équipe de Ma Taotao^[13]a révélé que le dialogue intercellulaire médié par les exosomes entre les cellules épithéliales tubulaires rénales et les macrophages joue un rôle important dans le traitement de la néphropathie diabétique ; l’équipe de Zhang Songying^[14]a constaté que la régulation du métabolisme des cellules décidualesNK(maternelles) améliore ainsi la sécrétion, par les cellules décidualesNK, des facteurs nécessaires au développement placentaire.La valeur des exosomes pour le diagnostic clinique, le traitement des maladies et la régénération tissulaire étant devenue de plus en plus évidente ces dernières années, les chercheurs du monde entier ont étudié toujours plus en profondeur leurs propriétés et leur structure particulières.

Les méthodes traditionnelles de séparation des exosomes comprennent l’ultracentrifugation, la filtration, les billes immunomagnétiques et les puces microfluidiques^[15]. L’ultracentrifugation est difficile à généraliser en raison du coût élevé de l’équipement. Les billes immunomagnétiques introduisent des composants étrangers qui limitent l’utilisation clinique. Les puces microfluidiques offrent une grande pureté de séparation, mais leur rendement est très faible et leur mise à l’échelle difficile. Bien que la filtration soit une technique mature, elle est actuellement réalisée manuellement, ce qui demande beaucoup de travail et de temps et accroît le risque de contamination^[16-17]。

Cette étude améliore la méthode de filtration, optimise les tailles de pores et les étages de filtration, et développe une commande intelligente de l’ensemble du processus afin de répondre aux exigences cliniques d’efficacité, de rapidité et de sécurité. Les performances de l’instrument pour la préparation des exosomes ont ensuite été évaluées expérimentalement.

1 Méthodes

1.1 Conception de l’instrument

1.1.1 Configuration générale de l’instrument

L’instrument se compose de deux réservoirs, d’une unité de filtration multiétagée, d’un entraînement moteur, d’une pompe à piston, de deux capteurs de pression, d’un moteur, d’un mécanisme de mouvement linéaire, d’un écran tactile et d’autres composants (figure1). L’ensemble du système est commandé parPLCet un module d’acquisition de données. Les valeurs des capteurs de pression s’affichent en temps réel sur l’écran tactile, qui sert d’interface homme-machine. L’instrument propose des modes automatique et manuel, sélectionnables selon le scénario d’utilisation.

1.1.2 Flux de travail de l’instrument

Le procédé de concentration d’un liquide cible avec l’instrument est illustré à la figure2: le liquide est ajouté au réservoir 1 et l’alimentation est mise sous tension. Le contrôleur commande l’entraînement moteur, qui démarre et arrête le moteur. Lorsque le moteur fonctionne, le mécanisme de mouvement linéaire entraîne la pompe à piston. Un tube d’aspiration prélève le liquide du réservoir 1 et l’achemine par la tuyauterie vers l’unité de filtration multiétagée. Des capteurs de pression sont installés à l’entrée et à la sortie de l’unité afin de mesurer en temps réella différence entre les valeurs des capteurs de pression dans les chambres de stabilisation de pression des premier et deuxième étages. Les temps de marche et d’arrêt de la pompe à piston sont ajustés en fonction de cette différence, afin de maintenir une pression différentielle constante aux bornes de l’unité de filtration multiétagée. Le liquide traverse ainsi l’unité de filtration multiétagée, qui filtre automatiquement les particules selon leur diamètre. À la fin d’un cycle, les particules plus petites que la taille des pores de la membrane la plus fine et le liquide résiduel sont évacués par la conduite terminale vers le réservoir 2. Les chercheurs peuvent recueillir le produit souhaité à l’étage approprié de l’unité de filtration.

Figure1 Système entièrement automatiséd’isolement et de concentrationdes exosomes

Fig.1 Automatic Exosome Filtration Instrument

Figure2 Schéma du flux de travail de l’instrument

Fig.2 Instrument work flow chart

1.2 Évaluation des performances de l’instrument

1.2.1 Matériel expérimental

1.2.1.1 Principaux réactifs expérimentaux

supplément de culture de cellules souches adipeuses (UltraGRO^TM，AventaCell BioMedical, États-Unis) ;PBS（Gibco, États-Unis)；0.25%trypsine (Gibco, États-Unis) ; sérum bovin fœtal (Gibco, États-Unis) ; solution de triple antibiotique (Gibco，États-Unis) ;α-MEM, à faible et forte teneur en glucoseDMEM（Gibco, États-Unis) ; collagénase (Collagenase NB4，Serva, Allemagne) ; BCAkit de dosage des protéines (Beyotime, Chine).

1.2.1.2Principaux instruments expérimentaux

stérile à usage unique10 cmboîtes de culture (BD, États-Unis)；100 kDatubes d’ultrafiltration (Milipore, États-Unis)；poste de sécurité microbiologique (Suzhou Purification Equipment Co., Ltd., Chine) ; lecteur de microplaques (Thermo Fisher Scientific, États-Unis)；balance électronique de précision (Longcheng Instrument Equipment Co., Ltd., Chine) ; cytomètre en flux (Beckman，États-Unis)；centrifugeuse de paillasse à température réglable(Thermo Fisher Scientific, États-Unis);hémocytomètre (Shanghai Qiujing Biochemical Reagent Instrument Co., Ltd., Chine)；agitateur à température réglable (Taicang Huamei Biochemical Instrument Factory, Chine)；bain-marie thermostatique (Shanghai Hetian Scientific Instruments Co., Ltd., Chine).

1.2.2 Méthodes expérimentales

1.2.2.1Isolement et culture des cellules souches adipeuses

Le tissu adipeux utilisé dans cette étude provenait de l’abdomen ou de la face interne de la cuisse et correspondait à du tissu éliminé après une liposuccion. Tous les patients ont signé un formulaire de consentement éclairé autorisant le don de ce tissu à la recherche médicale. Le protocole de l’étude a été approuvé par le comité d’éthique du neuvième hôpital populaire de Shanghai, faculté de médecine de l’université Jiao Tong de Shanghai.

Après prélèvement du tissu adipeux donné, celui-ci a été digéré à la collagénase puis centrifugé afin d’isoler les cellules souches adipeuses primaires. Les cellules ont été ensemencées dansα-MEMun milieu de culture contenant10cmdes boîtes de culture et cultivées à5%CO₂，37°C. Lorsque les cellules approchaient80%-90%de confluence, une solution contenantEDTAde0.25%Repiquer les cellules après digestion à la trypsine. Utiliser le passage3des cellules souches dérivées du tissu adipeux pour l’extraction des exosomes.

1.2.2.2Extraction des exosomes de cellules souches dérivées du tissu adipeux

Transférer le passage recueilli3du surnageant de cellules souches dérivées du tissu adipeux dans le réservoir d’entrée de l’extracteur d’exosomes et le filtrer avec l’instrument. Ajouter le filtrat recueilli dans un100kDademiliporetube d’ultrafiltration afin d’extraire les exosomes par ultrafiltration. Centrifuger à3000g，15-20min，4℃ jusqu’à ce que la quasi-totalité du surnageant du tube d’ultrafiltration interne ait traversé la membrane, puis utiliserPBSpour effectuer un lavage et centrifuger jusqu’à ce qu’il ne reste que200-500μLdePBScontenant les exosomes. Après centrifugation, aspirer lePBScontenant les exosomes et le conserver à4℃ au réfrigérateur.

1.2.2.3Identification des exosomes dérivés de cellules souches adipeuses

Les méthodes de séparation actuelles permettent difficilement d’obtenir des exosomes exceptionnellement purs et homogènes. Les exosomes obtenus après centrifugation de l’échantillon concentré par l’instrument doivent donc être identifiés. Afin de garantir l’exactitude, cette étude a employé trois méthodes d’identification conformément aux normes de l’International Society for Extracellular Vesicles.① Microscopie électronique en transmission (TEM) pour observer la morphologie des exosomes prétraités^[18];② Analyse de suivi des nanoparticules fondée sur la taille (NTA) : un faisceau lumineux éclaire les particules de l’échantillon d’exosomes, et la trajectoire de chaque particule est enregistrée à partir de la lumière diffusée et du mouvement brownien. La vitesse moyenne et le coefficient de diffusion peuvent alors être déterminés et utilisés dans des calculs mathématiques afin d’obtenir la concentration et la distribution granulométrique des exosomes^[19];③ Western blot (Western Blot) pour détecter les protéines de surface spécifiques des exosomesmarker ^[20]。

1.2.3 Principaux critères d’observation

①la microscopie électronique en transmissionObserver la morphologie des exosomes dérivés de cellules souches adipeuses ;②analyse de suivi des nanoparticules,analyse permettant de déterminer la taille et la concentration des particules d’exosomes ;③ Identification par Western blot des protéines exprimées par les exosomes dérivés de cellules souches adipeuses.

2 Résultats

2.1 Morphologie des cellules souches dérivées du tissu adipeux

Figure3（a) montre le tissu adipeux lavé et purifié ; la figure3（b）montre des cellules souches adipeuses humaines au troisième passage présentant une morphologie fusiforme allongée au microscope inversé.

2.2 Identification des exosomes par microscopie électronique en transmission

Comme illustré à la figure4（a),en microscopie électronique en transmission, les exosomes de cellules souches adipeuses mesuraient30nm-200nmet présentaient la morphologie ronde et cupuliforme typique des exosomes.

2.3 Identification des marqueurs d’exosomes par Western blot

Selon la norme de l’International Society for Extracellular Vesicles^[21], une vésicule ne peut être qualifiée d’exosome que si elle contient une protéine de membrane plasmique endosomale ou exosomale et une protéine cytosolique associée à la sécrétion des exosomes, tout en excluant une protéine structurale non exosomale ou une protéine cytosolique largement distribuée. Comme le montre la figure4（b), le Western blot a détecté l’expression de la protéine de membrane plasmique exosomaleCD63、CD81et du complexe protéiqueESCRTassocié à la sécrétionTSG101, tandis que la protéine de l’appareil de GolgiGM130était très faiblement exprimée, démontrant que le produit isolé contenait des exosomes d’une pureté relativement élevée.

2.4 Analyse de suivi des nanoparticules des exosomes

Comme illustré à la figure5montre que l’analyse de suivi des nanoparticules a révélé une distribution granulométrique concentrée entre30nm-200nm; la concentration et la taille des particules correspondaient aux caractéristiques des exosomes^[22]。

Figure3 Matériel expérimental. (a) Tissu adipeux utilisé dans l’expérience ; (b) Morphologie des cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux

Fig.3 Experimental materials.(a)Fat used in experiments；(b)Morphology of human adipose stem cells

Figure4 Morphologie des exosomes et identification des protéines spécifiques. (a) Morphologie des exosomes observée en microscopie électronique en transmission ; (b) Détection de l’expression des protéines exosomales par Western blot

Fig.4 Exosome morphology and specific protein identification.(a)Morphological characteristics of exosomes displayed by transmission electron microscopy;(b)Western blotting to detect exosome protein expression

Figure5 Distribution granulométrique des exosomes mesurée par NTA
Fig.5 NTA detection of exosome particle size distribution

3 Discussion

L’évaluation des performances du séparateur d’exosomes entièrement automatisé à filtration multiétagée a utilisé des cellules souches autologues dérivées du tissu adipeux comme matière première. L’intérêt clinique de l’extraction d’exosomes à partir de ces cellules tient au fait que le tissu adipeux autologue est abondant et facile à obtenir, ne provoque aucun rejet et se prête aisément à l’utilisation. En outre, leséparateur d’exosomes entièrement automatisé à filtration multiétagée adopte une conception sans contact avec une commande intelligente en boucle fermée, réduisant efficacement les coûts de main-d’œuvre et produisant des exosomes de grande pureté, exempts de contamination et conformes aux exigences cliniques.L’évaluation expérimentale a montré qu’après la concentration et l’extraction par centrifugation des exosomes de cellules souches adipeuses, les trois méthodes d’identification normalisées ont confirmé que les microparticules extraites étaient des exosomes et que la contamination se situait dans la plage normale. Cela démontre que l’instrument entièrement automatisé de filtration des exosomes peut filtrer et concentrer un surnageant contenant des exosomes, puis isoler des exosomes intacts à partir du concentré. Le temps de traitement requis est nettement inférieur à celui des méthodes d’extraction traditionnelles et répond aux exigences des applications cliniques.

L’instrument réalisé peut séparer précisément les sous-populations d’exosomes selon la taille des particules (30-150nm), fournissant un outil précieux pour étudier la relation entre la structure et la fonction des sous-populations d’exosomes, ainsi qu’une méthode rapide, efficace et économe en main-d’œuvre pour le traitement clinique. L’instrument présente encore certaines limites : des exosomes adhèrent à la membrane filtrante, entraînant une perte de produit et une diminution de l’activité. Les travaux futurs amélioreront encore l’extracteur en adoptant de nouvelles méthodes de filtration, notamment la filtration tangentielle, afin de corriger cette limite, de réduire le gaspillage de concentré et d’augmenter le rendement en exosomes.

4 Conclusion

L’instrument entièrement automatisé à filtration multiétagée sépare les exosomes rapidement et efficacement, répond aux exigences des applications cliniques et apporte un soutien solide aux traitements cliniques des maladies fondés sur les exosomes.

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