多段ろ過式全自動エクソソーム分離装置の開発と性能評価

全自動多段ろ過式エクソソーム分離装置を開発し、ヒト自家脂肪由来幹細胞のエクソソームを抽出して性能を評価しました。方法：装置の分離工程を策定し、装置構造を設計して、装置のハードウェアとソフトウェアの開発を完了しました。患者から自家脂肪を採取し、消化後に脂肪由来幹細胞を取得して継代培養しました。第3継代の脂肪由来幹細胞培養上清を回収して予備遠心し、その上清を第1貯液タンクに入れて装置でろ過しました。得られた第3段階のろ液を遠心してエクソソームを抽出しました。透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）でエクソソームの形態を観察し、ナノ粒子トラッキング解析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA），で粒径と粒子濃度を解析し、さらにウェスタンブロット法（Western Blot）で脂肪由来幹細胞エクソソームの特異的タンパク質発現を検出しました。発現指標にはCD63、CD81、TSG101が含まれ、同時にGM130も測定して、試料中の小胞の汚染程度を判定しました。結果：完了したのは全自動多段ろ過式エクソソーム分離装置の開発です。装置でろ過・濃縮し、遠心後に抽出した脂肪由来幹細胞エクソソームは、透過型電子顕微鏡観察で円形のカップ状を示し、ナノ粒子トラッキング解析で得られたエクソソームの大部分は50nm-200nmの範囲にありました。ウェスタンブロット法による検出では、抽出したエクソソームにCD63、CD81、TSG101の発現が確認され、エクソソームの収量は75%に達し、小胞の汚染状態は正常範囲内でした。結論：全自動多段ろ過式エクソソーム分離装置は、エクソソームを効率的かつ迅速に分離でき、臨床応用の要件を満たしました。臨床におけるエクソソームを用いた疾患治療を力強く支援します。

キーワード：エクソソーム；脂肪由来幹細胞；ろ過；濃縮；抽出

Multistage Filtration Based Fully Automated Exosomes Separation Instrument and Its Performance Evaluation

Zeng Yangtian¹ Zheng Yi² Liu Kai^2* Li Hong^1*

1(Hangzhou Baiqiao Medical Technology Co.,Ltd., Hangzhou 310018)

2 (Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011)

3 (EVERFINE Test and Calibration Technology Co., Ltd, Hangzhou, Hangzhou 310053)

Abstract: Objective: to develop a fully automated multistage filtration instrument for the separation of exosomes and to evaluate the performance by extracting human autologous adipose-derived stem cells(ADSCs) exosomes. Methods: To determine the instrument separation process, design the instrument structure and complete the instrument development of both hardware and software; to obtain and digest the autologous fat from patients, obtain and subculture the adipose-derived stem cells, collect the supernatant of the third generation adipose-derived stem cell culture and make initial centrifugation, add the supernatant to the first reservoir then filter through the instrument, centrifuge the obtained third stage filtrate and extract exosomes. The morphology of the exosomes was observed by Transmission Electron Microscope (TEM). Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) was performed to analyze particle size and concentration. Western Blot (WB)was used to detect the specific protein expression of the adipose-derived stem cells exosomes, which including CD63, CD81, TSG101 and GM130.And the Western Blot Method also was used to detect the contamination extent of vesicles in the assay samples. Results: The development of a fully automated multistage filtration and separation instrument for exosomes was completed. The adipose-derived stem cell exosomes, which extracted by the instrument after filtration and concentration and centrifugation, were observed in a circular-cup shape by TEM. Most of the exosomes obtained by NTA were in the range of 50 nm-200 nm. WB showed that the extracted exosomes contained the expression of CD63, CD81, TSG101 and CD81. Exosomes were obtained up to 75% and vesicle contamination was within the normal range. Conclusion: The fully automated multistage filtration and separation of exosomes instrument can achieve efficient and rapid separation of exosomes, which meets the requirements of clinical application and provides a strong support for clinical exosomes in disease treatment.

Keywords: Exosomes; Adipose-Derived Stem Cells; Filtration; Concentration; Extraction

はじめに

エクソソーム（exosome）は、直径が30～150nmの細胞外小胞です^[1-3]。研究^[4-8]によると、エクソソームは尿、胸腔・腹腔滲出液、乳汁、唾液などの体液に広く存在し、MSCs、血球、内皮細胞、神経細胞、腫瘍細胞など、多くの細胞がエクソソームを分泌できます。エクソソームは細胞内外の大量の生物学的情報を運び、細胞間コミュニケーションや細胞外マトリックス再構築の媒体として働き、人の健康と疾患に密接に関係しています^[9-10]，を噴霧吸入で投与するMSC-EVs経路は、急性呼吸窮迫症候群の治療に大きな意義があります^[11]。朱紅艶^[12]研究グループの研究では、CBSA/siS100A4が悪性乳がん細胞の増殖を著しく抑制できることが示されました。馬陶陶^[13]チームは、エクソソームを介した腎尿細管上皮細胞とマクロファージの相互対話が、糖尿病性腎症の治療過程で重要な役割を果たすことを明らかにしました。張松英^[14]教授のチームは、脱落膜NK細胞（母体由来）の代謝レベルを調節することで、脱落膜NK細胞が分泌する胎盤発生に必要な因子の量を改善できることを発見しました。近年、エクソソームが臨床診断、疾患治療、組織再生などで重要な価値を示すようになったため、世界各国の研究者はエクソソームの特殊な性質と構造を一層深く研究しています。

従来のエクソソーム分離法には、超遠心法、ろ過法、免疫磁気ビーズ法、マイクロ流体チップ法などがあります^[15]。超遠心法は装置が高価なため広く普及しにくく、免疫磁気ビーズ法は他の外来成分が混入するため臨床応用が困難です。マイクロ流体チップ法は分離純度が高いものの抽出量が少なく、大規模な普及が困難です。ろ過法は成熟した技術ですが、現時点では手作業で処理されており、手間と時間がかかり、汚染も生じやすいという問題があります^[16-17]。

本稿では、ろ過法を改良し、ろ過孔径とろ過段数について＊を行い、ろ過工程全体のインテリジェント制御を開発することで、臨床で求められる効率性、迅速性、安全性の要件への適合を目指すとともに、本装置によるエクソソーム調製効果を実験的に評価しました。

1 方法

1.1 装置設計

1.1.1 装置の全体構成

装置全体は、2つの貯液タンク、1つの多段ろ過ユニット、1つのモータードライバー、プランジャーポンプ、2つの圧力センサー、1つのモーター、直線運動機構、タッチスクリーンなどで構成されています（図1）。全体はPLCおよびデータ収集モジュールによって制御され、圧力センサーの値はタッチスクリーンにリアルタイムで表示されます。タッチスクリーンを介してヒューマンマシンインターフェースを実現し、装置は作業状況に応じて切り替えられる自動モードと手動モードを備えています。

1.1.2 装置の動作フロー

装置を用いて対象液を濃縮する工程を図2に示します。第1貯液タンクに液体を入れてスイッチを入れると、コントローラーがモータードライバーを制御し、モータードライバーがモーターの起動・停止を制御します。モーターが起動すると、直線運動機構がプランジャーポンプを駆動し、吸液管が第1貯液タンク内の液体を吸引した後、配管を通じて多段ろ過ユニットへ送ります。多段ろ過ユニットの入口と出口には圧力センサーが取り付けられており、リアルタイムで第1定圧室と第2定圧室の圧力センサーの差を検出し、その差に応じてプランジャーポンプの開閉時間を制御することで、多段ろ過ユニット内の圧力差を一定に保ちます。これにより液体が多段ろ過ユニットを通過し、直径の異なる微粒子を自動的にろ過できます。装置の運転終了後、多段ろ過ユニット最下層のろ過膜の孔径より小さい微粒子と廃液を、末端配管から第2貯液タンクへ排出します。実験担当者は必要に応じて、多段ろ過ユニットから目的物を回収できます。

図1 全自動エクソソーム分離・濃縮装置

Fig.1 Automatic Exosome Filtration Instrument

図2 装置動作フロー図

Fig.2 Instrument work flow chart

1.2 装置の性能評価

1.2.1 実験材料

1.2.1.1 実験に使用した主な試薬

脂肪由来幹細胞培養添加剤（UltraGRO^TM，AventaCell BioMedical、米国）。PBS（Gibco、米国）；0.25%トリプシン（Gibco、米国）；ウシ胎児血清（Gibco、米国）；三種混合抗生物質（Gibco，米国）；α-MEM、低グルコースおよび高グルコースDMEM（Gibco、米国）；コラゲナーゼ（Collagenase NB4，Serva、ドイツ）； BCAタンパク質定量キット（Beyotime、中国）。

1.2.1.2実験に使用した主な装置

使い捨て滅菌10 cm培養皿（BD、米国）；100 kDa限外ろ過チューブ（Milipore、米国）；クリーンベンチ（蘇州浄化設備有限公司、中国）；マイクロプレートリーダー（Thermo Fisher Scientific、米国）；微量電子天秤（隆成儀器設備有限公司、中国）；フローサイトメーター（Beckman，米国）；温度調節可能な卓上遠心分離機(Thermo Fisher Scientific、米国);血球計算盤（上海市求精生化試剤儀器有限公司、中国）；温度調節可能なシェーカー（太倉市華美生化儀器廠、中国）；恒温水浴槽（上海赫田科学儀器有限公司、中国）。

1.2.2 実験方法

1.2.2.1脂肪由来幹細胞の分離・培養

本研究で使用した脂肪は腹部または大腿内側に由来し、患者の脂肪吸引手術後に廃棄された脂肪です。患者は、廃棄脂肪を医学研究に提供することに同意するインフォームドコンセントに署名済みであり、研究計画は上海交通大学医学院附属第九人民医院の倫理委員会による承認を受けています。

提供された脂肪を採取後、コラゲナーゼで脂肪を消化し、遠心分離後に初代脂肪由来幹細胞を抽出しました。脂肪由来幹細胞を、脂肪由来幹細胞培養添加剤を含むα-MEM培地を入れた10cm培養皿に播種し、5%CO₂，37℃の条件で培養しました。細胞が80%-90%コンフルエンスに近づいた時点で、～を含むEDTAもの0.25%トリプシンで細胞を消化して継代しました。第3継代の脂肪由来幹細胞を用いてエクソソームを抽出しました。

1.2.2.2脂肪由来幹細胞由来エクソソームの抽出

回収した第3継代の脂肪由来幹細胞上清をエクソソーム抽出装置の供給タンクに入れ、装置でろ過しました。得られたろ液を100kDaものmilipore限外ろ過チューブに加え、限外ろ過法でエクソソームを抽出しました。3000g，15-20min，4℃で、限外ろ過チューブ内管の上清がほぼすべて遠心されるまで遠心し、その後PBSで1回洗浄し、内管に200-500μLのエクソソームを含むPBSだけが残るまで遠心しました。遠心完了後、エクソソームを含むPBSを吸引して取り出し、4℃の冷蔵庫で保存しました。

1.2.2.3脂肪由来幹細胞由来エクソソームの同定

現在の分離法では、極めて高純度で単一のエクソソームを得ることは困難です。そのため、装置で濃縮後、遠心して得たエクソソームを同定する必要があります。本研究では、国際細胞外小胞学会が策定した基準に基づき、同定の正確性を確保するため3種類の方法を採用しました。①透過型電子顕微鏡（TEM）で前処理後のエクソソームの形態を観察^[18];②サイズに基づくナノ粒子トラッキング解析（NTA）：光線をエクソソーム内の粒子に照射し、粒子の散乱光とブラウン運動から各粒子の軌跡を記録します。粒子運動の平均速度と拡散係数を求め、さらに数理計算によってエクソソームの濃度とサイズ分布を算出します^[19];③ウェスタンブロット法（Western Blot）でエクソソーム表面の特異的タンパク質を検出marker ^[20]。

1.2.3 主な観察指標

①透過型電子顕微鏡脂肪由来幹細胞由来エクソソームの形態を観察；②ナノ粒子トラッキング解析、解析によりエクソソームの粒径と濃度を取得；③ウェスタンブロット法により、脂肪由来幹細胞由来エクソソームの発現タンパク質を同定。

2 結果

2.1 脂肪由来幹細胞の形態

図3（a）は洗浄・精製した脂肪、図3（b）は第3継代のヒト脂肪由来幹細胞で、倒立顕微鏡による形態観察では長紡錘形を呈しました。

2.2 エクソソームの透過型電子顕微鏡による同定結果

図4（a）に示すとおり,透過型電子顕微鏡下で、脂肪由来幹細胞由来エクソソームの大きさは30nm-200nmの範囲にあり、エクソソームに典型的な円形のカップ状形態を呈しました。

2.3 エクソソームマーカーのウェスタンブロット法による同定結果

国際細胞外小胞学会の基準^[21]では、小胞がエクソソームと呼ばれるためには、エンドソームまたはエクソソームの形質膜タンパク質と、エクソソーム分泌に関連する細胞質タンパク質を含み、かつエクソソーム以外の構造または関連する広範な細胞質タンパク質が1つ除外されていなければなりません。図4（b）に示すとおり、ウェスタンブロット法によりエクソソーム形質膜タンパク質CD63、CD81の発現、および分泌に関連するESCRT複合体タンパク質中のTSG101の発現が検出されました。一方、ゴルジ体タンパク質GM130はほとんど発現せず、分離産物に高純度のエクソソームが含まれることが証明されました。

2.4 エクソソームのナノ粒子トラッキング解析結果

図5に示すとおり、ナノ粒子トラッキング解析で得られた粒径分布は30nm-200nmの範囲に集中しており、粒子濃度の結果もエクソソームの粒径特性に合致しました^[22]。

図3 実験材料。（a）実験に使用した脂肪；（b）ヒト脂肪由来幹細胞の形態

Fig.3 Experimental materials.(a)Fat used in experiments；(b)Morphology of human adipose stem cells

図4 エクソソームの形態および特異的タンパク質の同定。(a)透過型電子顕微鏡で示されたエクソソームの形態的特徴；(b)ウェスタンブロット法によるエクソソームタンパク質発現の検出

Fig.4 Exosome morphology and specific protein identification.(a)Morphological characteristics of exosomes displayed by transmission electron microscopy;(b)Western blotting to detect exosome protein expression

図5 NTAによるエクソソーム粒径分布の測定
Fig.5 NTA detection of exosome particle size distribution

3 考察

多段ろ過式全自動エクソソーム分離装置の性能評価試験では、自家脂肪由来幹細胞を原料に使用しました。自家脂肪由来幹細胞からエクソソームを抽出する臨床的意義は、自家脂肪は供給源が豊富で採取しやすく、拒絶反応も起こさないため応用しやすい点にあります。また、全自動多段ろ過式エクソソーム分離装置は非接触設計を採用し、インテリジェントな閉ループ制御設計を組み込んでいます。これにより人件費を効果的に削減し、高純度で汚染のないエクソソームを抽出して、臨床で求められるエクソソームの基準を満たすことができます。実験評価の結果、脂肪由来幹細胞由来エクソソームを濃縮・遠心抽出し、エクソソームを同定する3つの標準的方法で検査したところ、抽出された微粒子はエクソソームであり、汚染度は正常範囲内でした。これは、全自動エクソソームろ過装置でエクソソームを含む上清をろ過・濃縮し、得られた濃縮液を分離することで完全なエクソソームを取得できることを証明しています。エクソソーム抽出に必要な処理時間は従来の抽出法より大幅に短く、臨床応用の要件を満たしました。

本装置の完成により、異なるサブグループに属するエクソソームの粒子サイズ（30-150nm）を正確に細分化して抽出でき、エクソソームサブグループの構造と機能の関係を研究するための有用なツールと、臨床治療のための迅速・高効率・省力的な手段を提供します。現在も本装置には一定の課題があり、一部のエクソソームがろ過膜に付着して、産物の損失や活性低下を招きます。今後の研究ではエクソソーム抽出装置をさらに改良し、タンジェンシャルフローなどの新しいろ過法を採用してこの欠点を是正し、濃縮液の無駄を減らして、より高いエクソソーム収量の達成を目指します。

4 結論

全自動多段ろ過式エクソソーム分離装置は、エクソソームを効率的かつ迅速に分離でき、臨床応用の要件を満たしました。臨床におけるエクソソームを用いた疾患治療を力強く支援します。

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