Vollautomatische Exosomentrennung durch mehrstufige Filtration und Leistungsbewertung

Ein vollautomatisches Mehrstufen-Filtrationsgerät zur Trennung von Exosomen wurde entwickelt und seine Leistung anhand der Extraktion von Exosomen aus humanen autologen Fettstammzellen bewertet.Methoden：Trennverfahren des Geräts festlegen, Aufbau konstruieren und Hardware- sowie Softwareentwicklung abschließen;autologes Fettgewebe von Patienten gewinnen, durch Verdau isolieren, um Fettstammzellen zu erhalten, und die Zellen kultivieren und passagieren. Kulturüberstand von Fettstammzellen der dritten Passage sammeln und vorzentrifugieren. Den Überstand in den Behälter der ersten Stufe geben und mit dem Gerät filtrieren; anschließend das Filtrat der dritten Stufe zentrifugieren, um Exosomen zu extrahieren. Verwendung vonTransmissionselektronenmikroskopie（Transmission Electron Microscope，TEM) zur Beobachtung der Exosomenmorphologie und Durchführung einer Nanopartikel-Tracking-Analyse (Nanoparticle Tracking Analysis，NTA），zur Analyse von Partikelgröße und -konzentration sowie Western Blot (Western Blot) zum Nachweis der Expression von Proteinen, die für aus Fettstammzellen stammende Exosomen spezifisch sind. Zu den Expressionsmarkern gehörenCD63、CD81、TSG101, gleichzeitig wurde außerdemGM130nachgewiesen, um den Grad der Vesikelverunreinigung in der untersuchten Probe zu bestimmen.Ergebnisse：Abgeschlossen wurde dieEntwicklung des vollautomatischen Mehrstufen-Filtrationsgeräts zur Exosomentrennung. Die nach Filtration, Konzentrierung und Zentrifugation gewonnenen Exosomen aus Fettstammzellen erschienen unter dem Transmissionselektronenmikroskop rund und becherförmig. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse zeigte, dass die meisten Exosomen innerhalb von50nm-200nmlagen; Western Blot zeigte, dass die extrahierten ExosomenCD63、CD81、TSG101exprimierten, wobei die Exosomenausbeute75%erreichte und die Vesikelverunreinigung im Normalbereich lag.Schlussfolgerung：Das vollautomatische Mehrstufen-Filtrationsgerät trennt Exosomen schnell und effizient, erfüllt die Anforderungen klinischer Anwendungen und bietet eine starke Unterstützung für die klinische Behandlung von Erkrankungen mit Exosomen.

Schlüsselwörter:Exosomen; Fettstammzellen; Filtration; Konzentrierung; Extraktion

Multistage Filtration Based Fully Automated Exosomes Separation Instrument and Its Performance Evaluation

Zeng Yangtian¹ Zheng Yi² Liu Kai^2* Li Hong^1*

1(Hangzhou Baiqiao Medical Technology Co.,Ltd., Hangzhou 310018)

2 (Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011)

3 (EVERFINE Test and Calibration Technology Co., Ltd, Hangzhou, Hangzhou 310053)

Abstract: Objective: to develop a fully automated multistage filtration instrument for the separation of exosomes and to evaluate the performance by extracting human autologous adipose-derived stem cells(ADSCs) exosomes. Methods: To determine the instrument separation process, design the instrument structure and complete the instrument development of both hardware and software; to obtain and digest the autologous fat from patients, obtain and subculture the adipose-derived stem cells, collect the supernatant of the third generation adipose-derived stem cell culture and make initial centrifugation, add the supernatant to the first reservoir then filter through the instrument, centrifuge the obtained third stage filtrate and extract exosomes. The morphology of the exosomes was observed by Transmission Electron Microscope (TEM). Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) was performed to analyze particle size and concentration. Western Blot (WB)was used to detect the specific protein expression of the adipose-derived stem cells exosomes, which including CD63, CD81, TSG101 and GM130.And the Western Blot Method also was used to detect the contamination extent of vesicles in the assay samples. Results: The development of a fully automated multistage filtration and separation instrument for exosomes was completed. The adipose-derived stem cell exosomes, which extracted by the instrument after filtration and concentration and centrifugation, were observed in a circular-cup shape by TEM. Most of the exosomes obtained by NTA were in the range of 50 nm-200 nm. WB showed that the extracted exosomes contained the expression of CD63, CD81, TSG101 and CD81. Exosomes were obtained up to 75% and vesicle contamination was within the normal range. Conclusion: The fully automated multistage filtration and separation of exosomes instrument can achieve efficient and rapid separation of exosomes, which meets the requirements of clinical application and provides a strong support for clinical exosomes in disease treatment.

Keywords: Exosomes; Adipose-Derived Stem Cells; Filtration; Concentration; Extraction

Einleitung

Exosomen (exosome) sind extrazelluläre Vesikel mit einem Durchmesser von30～150nmextrazelluläre Vesikel^[1-3]; Studien^[4-8]zeigen, dass Exosomen in Körperflüssigkeiten wie Urin, Pleura- und Peritonealergüssen, Milch und Speichel weit verbreitet sind. Viele Zelltypen können Exosomen sezernieren, darunterMSCs, Blutzellen, Endothelzellen, Neuronen und Tumorzellen. Exosomen transportieren umfangreiche intra- und extrazelluläre biologische Informationen, wirken als Vermittler der Zellkommunikation und des Umbaus der extrazellulären Matrix und stehen in engem Zusammenhang mit Gesundheit und Krankheit des Menschen^[9-10]，durch AerosolinhalationMSC-EVsals Verabreichungsweg ist von großer Bedeutung für die Behandlung des akuten Atemnotsyndroms^[11]; die Forschungsgruppe von Zhu Hongyan^[12]zeigte:CBSA/siS100A4kann das Wachstum bösartiger Brustkrebszellen deutlich hemmen; das Team von Ma Taotao^[13]wies nach, dass der durch Exosomen vermittelte Austausch zwischen renalen Tubulusepithelzellen und Makrophagen bei der Behandlung diabetischer Nephropathie eine wichtige Rolle spielt; das Team von Zhang Songying^[14]stellte fest, dass die Regulierung des Stoffwechsels dezidualerNKZellen (mütterlich) dadurch die Sekretion von Faktoren verbessert, die für die Plazentaentwicklung benötigt werden, durch dezidualeNKZellen.Da der Wert von Exosomen für klinische Diagnostik, Krankheitsbehandlung und Geweberegeneration in den vergangenen Jahren immer deutlicher wurde, untersuchen Forschende weltweit ihre besonderen Eigenschaften und Strukturen zunehmend eingehend.

Zu den herkömmlichen Verfahren zur Exosomentrennung gehören Ultrazentrifugation, Filtration, Immunmagnetkügelchen und mikrofluidische Chips^[15]. Die Ultrazentrifugation lässt sich aufgrund der teuren Ausrüstung nur schwer breit einsetzen. Immunmagnetkügelchen bringen Fremdkomponenten ein, die den klinischen Einsatz einschränken. Mikrofluidische Chips erreichen eine hohe Trennreinheit, liefern jedoch nur sehr geringe Ausbeuten und sind schwer zu skalieren. Obwohl die Filtration ausgereift ist, wird sie derzeit manuell durchgeführt, wodurch sie arbeits- und zeitaufwendig sowie kontaminationsanfällig ist^[16-17]。

Diese Studie verbessert das Filtrationsverfahren, optimiert Filterporengrößen und Stufen und entwickelt eine intelligente Steuerung des gesamten Ablaufs, um klinische Anforderungen an Effizienz, Schnelligkeit und Sicherheit zu erfüllen. Anschließend wurde die Leistung des Geräts bei der Exosomenpräparation experimentell bewertet.

1 Methoden

1.1 Gerätekonstruktion

1.1.1 Gesamtaufbau des Geräts

Das Gerät besteht aus zwei Behältern, einer mehrstufigen Filtereinheit, einem Motorantrieb, einer Kolbenpumpe, zwei Drucksensoren, einem Motor, einem Linearbewegungsmechanismus, einem Touchscreen und weiteren Komponenten (Abbildung1). Das gesamte System wird gesteuert durchPLCund ein Datenerfassungsmodul. Die Messwerte der Drucksensoren werden in Echtzeit auf dem Touchscreen angezeigt; zugleich dient der Touchscreen als Mensch-Maschine-Schnittstelle. Das Gerät bietet einen automatischen und einen manuellen Modus, die je nach Anwendung gewählt werden können.

1.1.2 Arbeitsablauf des Geräts

Der Ablauf zur Konzentrierung einer Zielflüssigkeit mit dem Gerät ist in Abbildung2dargestellt: Flüssigkeit wird in Behälter 1 gegeben und die Stromversorgung eingeschaltet. Die Steuerung betätigt den Motorantrieb, der den Motor startet und stoppt. Bei laufendem Motor treibt der Linearbewegungsmechanismus die Kolbenpumpe an. Ein Saugrohr zieht Flüssigkeit aus Behälter 1 und leitet sie durch die Rohrleitungen zur mehrstufigen Filtereinheit. Am Ein- und Ausgang der Einheit sind Drucksensoren installiert, die in Echtzeitdie Differenz zwischen den Drucksensorwerten in der ersten und zweiten Druckstabilisierungskammer messen. Die Ein- und Ausschaltzeiten der Kolbenpumpe werden entsprechend dieser Differenz angepasst, sodass über der mehrstufigen Filtereinheit ein konstanter Differenzdruck erhalten bleibt. Dadurch wird die Flüssigkeit durch die mehrstufige Filtereinheit gedrückt und Partikel werden automatisch nach Durchmesser getrennt. Am Ende eines Durchlaufs werden Partikel, die kleiner als die Porengröße der untersten Membran der Einheit sind, zusammen mit der Abfallflüssigkeit über die Endleitung in Behälter 2 abgeführt. Forschende können das gewünschte Produkt aus der entsprechenden Stufe der Filtereinheit entnehmen.

Abbildung1 Vollautomatische Exosomen-Isolierung und KonzentrierungGerät

Fig.1 Automatic Exosome Filtration Instrument

Abbildung2 Ablaufdiagramm des Geräts

Fig.2 Instrument work flow chart

1.2 Leistungsbewertung des Geräts

1.2.1 Versuchsmaterialien

1.2.1.1 Wichtige Versuchsreagenzien

Zusatz für die Fettstammzellkultur (UltraGRO^TM，AventaCell BioMedical, USA);PBS（Gibco, USA)；0.25%Trypsin (Gibco, USA); fetales Rinderserum (Gibco, USA); Dreifach-Antibiotikalösung (Gibco，USA);α-MEM, niedrig- und hochglukosehaltigDMEM（Gibco, USA); Kollagenase (Collagenase NB4，Serva, Deutschland); BCAProteinbestimmungskit (Beyotime, China).

1.2.1.2Wichtige Versuchsgeräte

sterile Einweg-10 cmKulturschalen (BD, USA)；100 kDaUltrafiltrationsröhrchen (Milipore, USA)；Reinraumwerkbank (Suzhou Purification Equipment Co., Ltd., China); Mikroplattenleser (Thermo Fisher Scientific, USA)；Präzisions-Elektronikwaage (Longcheng Instrument Equipment Co., Ltd., China); Durchflusszytometer (Beckman，USA)；temperierbare Tischzentrifuge(Thermo Fisher Scientific, USA);Hämozytometer (Shanghai Qiujing Biochemical Reagent Instrument Co., Ltd., China)；temperierbarer Schüttler (Taicang Huamei Biochemical Instrument Factory, China)；Thermostat-Wasserbad (Shanghai Hetian Scientific Instruments Co., Ltd., China).

1.2.2 Versuchsmethoden

1.2.2.1Isolierung und Kultur von Fettstammzellen

Das in dieser Studie verwendete Fettgewebe stammte aus dem Bauch oder der Innenseite des Oberschenkels und war Gewebe, das nach einer Fettabsaugung bei Patienten verworfen wurde. Alle Patienten unterzeichneten Einwilligungserklärungen, in denen sie der Spende des verworfenen Gewebes für die medizinische Forschung zustimmten. Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission des Shanghai Ninth People’s Hospital der Shanghai Jiao Tong University School of Medicine genehmigt.

Nach Gewinnung des gespendeten Fettgewebes wurde es mit Kollagenase verdaut und zentrifugiert, um primäre Fettstammzellen zu isolieren. Die Zellen wurden inα-MEMKulturmedium mit10cmKulturschalen ausgesät und bei5%CO₂，37°C kultiviert. Als sich die Zellen einer80%-90%Konfluenz näherten, wurde eine Lösung mitEDTAvon0.25%Die Zellen durch Trypsinverdau passagieren. Passage3adipöse Stammzellen zur Exosomenextraktion verwenden.

1.2.2.2Extraktion von Exosomen aus adipösen Stammzellen

Den gesammelten Überstand der Passage3adipöser Stammzellen in den Einlassbehälter des Exosomenextraktors überführen und mit dem Gerät filtrieren. Das gewonnene Filtrat in ein100kDavonmiliporeUltrafiltrationsröhrchen geben, um Exosomen durch Ultrafiltration zu extrahieren. Zentrifugieren bei3000g，15-20min，4℃, bis nahezu der gesamte Überstand im inneren Ultrafiltrationsröhrchen passiert ist; anschließend einmal mitPBSwaschen und zentrifugieren, bis nur noch200-500μLder exosomenhaltigenPBSzurückbleibt. Nach der Zentrifugation die exosomenhaltigePBSabsaugen und bei4℃ im Kühlschrank lagern.

1.2.2.3Identifizierung von Exosomen aus adipösen Stammzellen

Mit den derzeitigen Trennverfahren ist es schwierig, außergewöhnlich reine und homogene Exosomen zu gewinnen. Die durch Zentrifugation der im Gerät konzentrierten Probe gewonnenen Exosomen müssen daher identifiziert werden. Diese Studie verwendete entsprechend den Standards der International Society for Extracellular Vesicles drei Identifizierungsverfahren, um die Genauigkeit sicherzustellen.① Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zur Beobachtung der Morphologie vorbehandelter Exosomen^[18];② Größenbasierte Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA): Ein Lichtstrahl beleuchtet Partikel in der Exosomenprobe; die Bahn jedes Partikels wird anhand seines Streulichts und seiner Brownschen Bewegung aufgezeichnet. Daraus lassen sich mittlere Geschwindigkeit und Diffusionskoeffizient bestimmen und mathematisch zur Ermittlung von Exosomenkonzentration und Größenverteilung verwenden^[19];③ Western Blot (Western Blot) zum Nachweis exosomenspezifischer Oberflächenproteinemarker ^[20]。

1.2.3 Primäre Beobachtungsendpunkte

①TransmissionselektronenmikroskopieMorphologie der Exosomen aus adipösen Stammzellen beobachten;②Nanopartikel-Tracking-Analyse,Analyse zur Bestimmung von Partikelgröße und Konzentration der Exosomen;③ Western-Blot-Identifizierung von Proteinen, die durch Exosomen aus adipösen Stammzellen exprimiert werden.

2 Ergebnisse

2.1 Morphologie adipöser Stammzellen

Abbildung3（a) zeigt gewaschenes und gereinigtes Fettgewebe; Abbildung3（b）zeigt humane adipöse Stammzellen der dritten Passage mit einer langen spindelförmigen Morphologie unter dem inversen Mikroskop.

2.2 Identifizierung von Exosomen durch Transmissionselektronenmikroskopie

Wie in Abbildung4（a) dargestellt,,maßen die Exosomen aus adipösen Stammzellen unter dem Transmissionselektronenmikroskop30nm-200nmund zeigten die typische runde, becherförmige Exosomenmorphologie.

2.3 Western-Blot-Identifizierung von Exosomenmarkern

Nach dem Standard der International Society for Extracellular Vesicles^[21]darf ein Vesikel nur dann als Exosom bezeichnet werden, wenn es ein endosomales oder exosomales Plasmamembranprotein und ein mit der Exosomensekretion verbundenes zytosolisches Protein enthält, während ein nicht exosomales Strukturprotein oder ein weit verbreitetes zytosolisches Protein ausgeschlossen wird. Wie in Abbildung4（b) dargestellt, wies der Western Blot die Expression des exosomalen PlasmamembranproteinsCD63、CD81und des sekretionsbezogenenESCRTKomplexproteinsTSG101nach, während das Golgi-ProteinGM130kaum exprimiert wurde. Dies belegt, dass das isolierte Produkt Exosomen relativ hoher Reinheit enthielt.

2.4 Nanopartikel-Tracking-Analyse der Exosomen

Wie in Abbildung5zeigt, dass die Nanopartikel-Tracking-Analyse eine auf den Bereich30nm-200nmkonzentrierte Partikelgrößenverteilung ergab; Partikelkonzentration und -größe entsprachen den Merkmalen von Exosomen^[22]。

Abbildung3 Versuchsmaterialien. (a) Im Versuch verwendetes Fettgewebe; (b) Morphologie humaner adipöser Stammzellen

Fig.3 Experimental materials.(a)Fat used in experiments；(b)Morphology of human adipose stem cells

Abbildung4 Exosomenmorphologie und Identifizierung spezifischer Proteine. (a) Mittels Transmissionselektronenmikroskopie dargestellte Exosomenmorphologie; (b) Western-Blot-Nachweis der Exosomenproteinexpression

Fig.4 Exosome morphology and specific protein identification.(a)Morphological characteristics of exosomes displayed by transmission electron microscopy;(b)Western blotting to detect exosome protein expression

Abbildung5 Durch NTA gemessene Partikelgrößenverteilung der Exosomen
Fig.5 NTA detection of exosome particle size distribution

3 Diskussion

Für die Leistungsbewertung des vollautomatischen Mehrstufen-Filtrationsgeräts zur Exosomentrennung wurden autologe adipöse Stammzellen als Ausgangsmaterial verwendet. Die klinische Bedeutung der Exosomenextraktion aus autologen adipösen Stammzellen liegt darin, dass autologes Fettgewebe reichlich vorhanden und leicht zu gewinnen ist, keine Abstoßungsreaktion verursacht und bequem verwendet werden kann. Darüber hinaus arbeitet dasvollautomatische Mehrstufen-Filtrationsgerät zur Exosomentrennung berührungslos und mit intelligenter Regelung im geschlossenen Kreis. Dadurch werden Arbeitskosten wirksam gesenkt und hochreine, kontaminationsfreie Exosomen erzeugt, die klinischen Anforderungen entsprechen.Die experimentelle Bewertung zeigte, dass nach Konzentrierung und zentrifugaler Extraktion der Exosomen aus adipösen Stammzellen alle drei Standardverfahren bestätigten, dass es sich bei den extrahierten Mikropartikeln um Exosomen handelte und die Kontamination im Normalbereich lag. Damit ist nachgewiesen, dass das vollautomatische Exosomen-Filtrationsgerät exosomenhaltigen Überstand filtrieren und konzentrieren sowie intakte Exosomen aus dem Konzentrat isolieren kann. Die erforderliche Bearbeitungszeit ist wesentlich kürzer als bei herkömmlichen Extraktionsverfahren und erfüllt die Anforderungen klinischer Anwendungen.

Das fertiggestellte Gerät kann Exosomen-Subpopulationen präzise nach Partikelgröße trennen (30-150nm) und bietet damit ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Struktur und Funktion von Exosomen-Subpopulationen sowie ein schnelles, effizientes und arbeitssparendes Verfahren für klinische Behandlungen. Das Gerät weist noch Einschränkungen auf: Einige Exosomen haften an der Filtermembran, wodurch Produktverluste entstehen und die Aktivität sinkt. Künftige Forschung wird den Exosomenextraktor durch neue Filtrationsverfahren wie Tangentialflussfiltration weiter verbessern, um diese Einschränkung zu beseitigen, Konzentratverluste zu reduzieren und die Exosomenausbeute zu erhöhen.

4 Schlussfolgerung

Das vollautomatische Mehrstufen-Filtrationsgerät trennt Exosomen schnell und effizient, erfüllt die Anforderungen klinischer Anwendungen und bietet eine starke Unterstützung für die klinische Behandlung von Erkrankungen mit Exosomen.

Literatur

[1] Raposo G,Stoorvogel W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.[J]. The Journal of cell biology,2013,200(4).

[2] Lee Y,El A S,Wood MJA. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.[J]. Human molecular genetics,2012,21(R1).

[3] Marqués-García F,Isidoro-García M. Protocols for Exosome Isolation and RNA Profiling.[J]. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.),2016,1434.

[4] Li P,Kaslan M,Lee SH,et al. Progress in exosome isolation tech-niques[J]. Theranostics,2017,7( 3) : 789-804.

[5] Clark DJ,Fondrie WE,Liao Z,et al. Redefining the breast cancer exosome proteome by tandem mass tag quantitative proteomics and m*riate cluster analysis[J]. Anal Chem,2015,87(20) : 10462-10469.

[6] Yu B,Zhang X,Li X. Exosomes derived from mesenchymal stem cell[J]. Int J Mol Sci,2014,15(3) : 4142-4157.

[7] Ye Dongman,Yu Tao. Extraktion und Identifizierung von Tumorexosomen[J]. Modern Oncology,2018,26(20),3341-3343.

[8] Chan BD，Wong WY,Lee MM,et al. Exosomes in inflammation and inflammatory disease[J]. Proteomics,2019,13: e1800149.

[9] MATHIEU M, MARTIN-JAULAR L, LAVIEU G, et al. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication [J]. Nat Cell Biol, 2019, 21(1): 9-17.

[10] SHU S, YANG Y, ALLEN C L, et al. Purity and yield of melanoma exosomes are dependent on isolation method [J]. J Extracell Vesicles, 2020, 9(1): 1692401.

[11] Shi MM, Yang QY, Monsel A, et al. Preclinical efficacy and clinical safety of clinical-grade nebulized allogenic adipose mesenchymal stromal cells-derived extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2021;10(10):e12134.

[12] Zhao L, Gu C, Gan Y, Shao L, Chen H, Zhu H. Exosome-mediated siRNA delivery to suppress postoperative breast cancer metastasis. J Control Release. 2020;318:1-15.

[13] Jiang WJ, Xu CT, Du CL, et al. Tubular epithelial cell-to-macrophage communication forms a negative feedback loop via extracellular vesicle transfer to promote renal inflammation and apoptosis in diabetic nephropathy. Theranostics. 2022;12(1):324-339.

[14] Jiang L, Fei H, Jin X, et al. Extracellular Vesicle-Mediated Secretion of HLA-E by Trophoblasts Maintains Pregnancy by Regulating the Metabolism of Decidual NK Cells. Int J Biol Sci. 2021;17(15):4377-4395.

[15] WEN S W, LIMA L G, LOBB R J, et al. Breast cancer-derived exosomes reflect the cell-of-origin phenotype [J]. Proteomics, 2019, 19(8): e1800180.

[16] Yang Dongbin,Zhang Weihong,Zhang Huanyun,Zhang Fengqiu,Chen Lanmei,Ma Lixia,Larcher Leon M,Chen Suxiang,Liu Nan,Zhao Qingxia,Tran Phuong H L,Chen Changying,Veedu Rakesh N,Wang Tao. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.[J]. Theranostics,2020,10(8).

[17] Bai Jun,Ren Jun,Wang Jun,Zhang Hongmei,Yang Jingyue,Zhang Liwang.Experimentelle Studie zur Exosomenextraktion durch Zentrifugalfiltration[J].Journal of the Fourth Military Medical University,2004(10):890-892.

[18] Lässer C,Eldh M,Lötvall J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.[J]. Journal of visualized experiments : JoVE,2012(59).

[19] Xiao-Xia Yang,Chao Sun,Lei Wang,Xiu-Li Guo. New insight into isolation, identification techniques and medical applications of exosomes[J]. Journal of Controlled Release,2019,308(C).

[20] Théry C,Amigorena S,Raposo G,Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.[J].Current protocols in cell biology,2006,Chapter 3(1).

[21] Théry C, Witwer KW, Aikawa E, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018;7(1):1535750. Published 2018 Nov 23. doi:10.1080/20013078.2018.1535750

[22] Wang Shuai,Li Chaoran,Zhang Qianru,Huang Guilin.Extraktion und Identifizierung von Exosomen aus humanen, aus Urin gewonnenen Stammzellen[J].Chinese Journal of Tissue Engineering Research,2022,26(13):2056-2061.