Quali sono i passi operativi dettagliati per uno strumento di misura della forza di adesione cellulare?

　　Strumento di misura della forza di adesione cellulareè uno strumento specializzato per misurare con precisione le forze di interazione tra cellule e un substrato, con applicazioni importanti in biologia cellulare, ingegneria biomedica e campi correlati. Misurando con precisione queste interazioni, aiuta i ricercatori a comprendere il comportamento cellulare e i meccanismi della malattia e sviluppare nuovi trattamenti. Ad esempio, il sistema CellHesion 200 della Germania JPK misura le interazioni cellulare-cellula e cellulare-sottostrato, misura quantitativamente l'elasticità cellulare e le risposte alla pressione meccanica external, e fornisce risultati quantitativi a singola cella con precisione monomolecolare. Il suo metodo innovativo supporta la ricerca di interazione cellulare con dati di alta qualità, e il suo software determina automaticamente i parametri chiave relativi alla forza di adesione cellulare.

　　Strumento di misura della forza di adesione cellularepassi operativi:

　　I. Preparazione sperimentale

　　Seleziona la proteina Matrix

　　Selezionare una proteina di matrice appropriata, come collagene, fibronectina o laminina, per l'obiettivo di ricerca. Prepararlo inPBSad una concentrazione adatta, come 2-10μg/mL, e ricoprire il fondo di una piastra di analisi come una piastra di 96-well uniformemente. Incubare durante la notte a 4°C o per 1-2 ore a 37°C per immobilizzare la proteina.

　　Bloccare siti non specifici

　　Bloccare la piastra di analisi a temperatura ambiente con 1%BSA (bovine siero albumina) o 10% siero bovino fetale per 30 minuti a 1 ora per ridurre l'adesione cellulare non specifica.

　　Preparazione della cella

　　Seleziona le celle in crescita logaritmica, digeriscile con la trippa, raccoglili per centrifugazione e li riutilizza in mezzo privo di siero. Regolare la concentrazione della cella a 5×104-5×105/mL in base al tipo di cella.

　　II. Set di strumenti

　　Calibrare il sensore

　　Seguendo il manuale dello strumento, calibrare il sensore di forza con un campione di riferimento come le celle o il materiale con la forza di adesione nota, garantendo la precisione di misura con la risoluzione tipica di 0.1nN.

　　Set Parametri

　　Tempo di contatto: impostare il tempo di contatto cellulare-matrice secondo l'esperimento, per esempio 5, 10, 15, 20 o 25 minuti.

　　Velocità di retrazione: impostare la velocità di retrazione della sonda, come 1μm/s, per garantire una misurazione dinamica stabile.

　　Controllo ambientale: se lo strumento include un modulo di controllo ambientale, impostare parametri come temperatura a 37°C e CO2 al 5% per simulare le condizioni fisiologiche.

　　III. Gestione e visualizzazione delle celle

　　Seed le celle

　　Aggiungete la sospensione della cella alla piastra di calcolo precoperta della matrice a 5000-1×105 celle per pozzo, regolate per la dimensione della piastra e utilizzate 3-5 pozzi replicati per ridurre l'errore.

　　Incubazione

　　Incubare la piastra di dosaggio in un incubatore a temperatura costante a 37°C e 5% CO2 per il periodo specificato per consentire l'attacco completo della cella.

　　IV. Misurazione

　　Rimuovere Celle non tagliate

　　Dopo l'incubazione, lavare delicatamente la piastra di dosaggio 2-3 volte conPBSpre-riscaldato per rimuovere le cellule non tagliate.

　　Fissare le celle (opzionale)

　　Per stoccaggio a lungo termine o successiva colorazione, fissare le celle in 4% paraformaldehyde per 15-20 minuti e poi lavare conPBS.

　　Misura di avvio

　　Metodo meccanico: abbassare la sonda cava fino a che non contatti la superficie cellulare. Interrompere quando l'uscita forza-misurement raggiunge la soglia impostata, come 50nN. Dopo il tempo di contatto specificato, ritrarre la sonda alla velocità impostata, come 1μm/s, attraverso una distanza di 60μm e registrare la curva di spostamento della forza.

　　Metodo di fluorescenza: quando viene utilizzato l'etichettatura fluorescente, misura l'intensità con un lettore di micropiatti di fluorescenza—ad esempio, l'etichettatura di calceina ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 488nm e la lunghezza d'onda di emissione di 520nm. L'intensità della fluorescenza è proporzionale al numero di cellule aderenti.

　　Microfluidici: applicare la forza di taglio in un microcanale, come 0,5-5 dina/cm2, per simulare il flusso fisiologico e monitorare le dinamiche di adesione cellulare in tempo reale. (0.5-5)

　　V. Registrazione e analisi dei dati

　　Estrarre i parametri chiave

　　Estrarre la forza di adesione massima, il tempo di adesione, l'area di adesione e altri parametri dalla curva di forza-spostamento, o calcolare il tasso di adesione dall'intensità della fluorescenza utilizzando: tasso di adesione = (gruppo sperimentale OD / gruppo di massima adesione-gruppo OD) × 100%.

　　Analisi statistica

　　Utilizzare software come il Prisma GraphPad per ANOVA, calcolare la deviazione standard e il coefficiente di variazione, e verificare il significato statistico a p (0.05)

　　Visualizzazione

　　Piazzole curve di aderenza-forza-con-temporali, diagrammi a barre adhesion-rate e altre visualizzazioni, e combinarli con immagini di microscopia come la colorazione di cristallo-violetto o Giemsa per presentare chiaramente i risultati.

　　VI. Pulizia post-esperiment

　　Pulire lo strumento

　　Sonde pulite, piatti di cultura e altri componenti con acqua deionizzata o un detergente dedicato in modo che i residui non influiscano sul prossimo esperimento.

　　Chiudi lo strumento

　　Spegnere il modulo di controllo ambientale, il modulo ottico e il sistema software in sequenza, quindi spegnere l'alimentazione.

　　Backup dei dati

　　Salvare i dati grezzi in un drive locale o cloud storage e creare un record sperimentale per la tracciabilità.