¿Cuáles son los pasos de funcionamiento detallados para un instrumento de medición de la fuerza de adherencia celular?

　　Instrumento de medición de la fuerza de adherencia celulares un instrumento especializado para medir precisamente las fuerzas de interacción entre células y un sustrato, con importantes aplicaciones en biología celular, ingeniería biomédica y campos relacionados. Mediante la medición precisa de estas interacciones, ayuda a los investigadores a comprender el comportamiento celular y los mecanismos de enfermedad y desarrollar nuevos tratamientos. Por ejemplo, el sistema CellHesion 200 de la JPK de Alemania mide interacciones celulares y celulares, mide cuantitativamente la elasticidad celular y las respuestas a la presión mecánicarnal y proporciona resultados cuantitativos de células únicas con precisión monomolécula. Su innovador método admite la investigación de interacción celular con datos de alta calidad, y su software determina automáticamente parámetros clave relacionados con la fuerza de adherencia celular.

　　Instrumento de medición de la fuerza de adherencia celularpasos operativos:

　　I. Preparación experimental

　　Seleccione la matriz Proteína

　　Seleccione una proteína matriz apropiada, como colágeno, fibronectina o lamina, para el objetivo de investigación. Prepáralo enPBSa una concentración adecuada, como 2-10μg/mL, y recubre el fondo de una placa de ensayo como una placa de 96-bien uniformemente. Incubar durante la noche a 4°C o durante 1-2 horas a 37°C para inmovilizar la proteína.

　　Block Nonspecific Binding Sites

　　Bloquear la placa de ensayo a temperatura ambiente con 1%BSA (bovine surum albumin) o 10% fetal bovine surum durante 30 minutos a 1 hora para reducir la adherencia celular no específica.

　　Preparación de células

　　Select cells in logarithmic growth, digest them with trippsin, collect them by centrifugation and resuspend them in serum-free medium. Ajuste la concentración celular a 5×104-5×105/mL según el tipo de célula.

　　II. Configuración de instrumentos

　　Calibrar el sensor

　　Siguiendo el manual del instrumento, calibrar el sensor de fuerza con una muestra de referencia como células o material con fuerza de adherencia conocida, asegurando la precisión de medición con resolución típica de 0.1nN.

　　Establecer parámetros

　　Tiempo de contacto: establecer el tiempo de contacto celular-matrix según el experimento, por ejemplo 5, 10, 15, 20 o 25 minutos.

　　Velocidad de retracción: establecer la velocidad de retracción de sonda, como 1μm/s, para asegurar una medición dinámica estable.

　　Control ambiental: si el instrumento incluye un módulo de control ambiental, establece parámetros tales como temperatura a 37°C y CO2 al 5% para simular condiciones fisiológicas.

　　III. Manejo de células y siembra

　　Seed the Cells

　　Añadir la suspensión celular a la placa de ensayo precoada de matriz-proteína a 5000-1×105 células por pozo, ajustada para el tamaño de la placa, y utilizar 3-5 pozos replicados para reducir el error.

　　Incubación

　　Incubar la placa de ensayo en una incubadora de temperatura constante a 37°C y 5% de CO2 para el período especificado para permitir el acceso completo de la célula.

　　IV. Medición

　　Retire las células sin ataque

　　Después de la incubación, lave suavemente la placa de ensayo 2-3 veces conPBSprecalentado para eliminar las células no atadas.

　　Fijar las células (Opcional)

　　Para almacenamiento a largo plazo o mancha posterior, fijar las células en 4% paraformaldehído durante 15-20 minutos y luego lavar conPBS.

　　Medición de inicio

　　Método mecánico: bajar la sonda hueca hasta que contacte con la superficie celular. Deténgase cuando la salida de medición de la fuerza alcance el umbral establecido, como 50nN. Después del tiempo de contacto especificado, retraer la sonda a la velocidad del set, como 1μm/s, a través de una distancia de 60μm y registrar la curva de desplazamiento de fuerza.

　　Método de fluorescencia: cuando se usa etiquetado fluorescente, mide intensidad con un lector de microplatos de fluorescencia, por ejemplo, etiquetado de calceína en una longitud de onda de excitación de 488nm y longitud de onda de emisión de 520nm. La intensidad de la fluorescencia es proporcional al número de células adherentes.

　　Microfluidics: aplicar la fuerza jerárquica en un microcanal, como 0,5-5 dyn/cm2, para simular el flujo fisiológico y monitorear dinámicas de adherencia celular en tiempo real. (0.5-5)

　　V. Registro y análisis de datos

　　Extracto de parámetros clave

　　Extraer la fuerza máxima de adherencia, tiempo de adherencia, área de adherencia y otros parámetros de la curva de desplazamiento de fuerza, o calcular la tasa de adherencia de la intensidad de fluorescencia utilizando: tasa de adherencia = (experimental-group OD / OD máximo-adhesión-grupo) × 100%.

　　Análisis estadístico

　　Use software como GraphPad Prism para ANOVA, calcule la desviación estándar y el coeficiente de variación, y verifique la significación estadística en piere0.05.

　　Visualización

　　Plot adhesion-force-versus-time curvas, gráficos de barras de presión y otras visualizaciones, y combinarlos con imágenes de microscopía como la mancha cristal-violeta o Giemsa para presentar claramente los resultados.

　　VI. Limpieza posterior al período

　　Limpiar el Instrumento

　　Sondas limpias, platos culturales y otros componentes con agua deionizada o un limpiador dedicado, por lo que los residuos no afectan el próximo experimento.

　　Cierra el Instrumento

　　Apaga el módulo de control ambiental, el módulo óptico y el sistema de software en secuencia, y luego apaga la potencia.

　　Data Backup

　　Guardar datos brutos a una unidad local o almacenamiento en la nube y crear un registro experimental para la trazabilidad.